MP/DPP復合物在體外對SK0V3細胞的抗腫瘤活性
[0073]在體外主要用兩種方法檢測VSVMP/DPP復合物對SK0V3細胞的抗腫瘤活性:MTT法和流式細胞術。
[0074]1.6.1用MTT法檢測VSVMP/DPP復合物對SK0V3細胞生長的抑制作用
[0075](1) SK0V3細胞接種96孔板方法詳見2.4 (1)
[0076](2)取1 μ g VSVMP質粒和空載P-VAX質粒分別稀釋于25 μ 1無血清無抗生素的DMEM培養基中，輕輕混勻。
[0077](3)取25 μ g制備好的DPP納米粒稀釋于25 μ 1無血清無抗生素的DMEM培養基中，輕輕混勻。
[0078](4)分別混合稀釋的VSVMP質粒、P-VAX質粒和DPP納米粒(總體積65 μ 1)，注意將稀釋的基因加入到稀釋的材料中，室溫靜置30min。
[0079](5)將96孔板中的培養基吸出，用PBS洗滌細胞2次，加無血清無抗生素的DMEM培養基100 μ 1。
[0080](6)將65 μ 1的VSVMP/DPP復合物、P-VAX/DPP復合物加到孔板中，同時將65 μ 1體積的DPP材料和0.9% NS也加到孔板中，每組設6個復孔，然后前后左右晃動混勻。
[0081](7)將96孔板放入37°C，5% 0)2細胞恒溫培養箱中孵育8小時后，移去孔板中的培養基，換成有血清有抗生素的DMEM培養基200 μ 1，放入孵箱繼續孵育40小時。
[0082](8)孵育完成后，每孔加入ΜΤΤ試劑(5mg/ml)20 μ 1，將細胞放入37°C，5% C02細胞恒溫培養箱中避光孵育3-4小時，后取出細胞，在倒置顯微鏡下觀察細胞內紫藍色結晶紫，顏色越深細胞活力越大。
[0083](9)最后棄掉培養基后，每孔加入100 μ 1 二甲基亞砜(DMS0)，將96孔板置于搖床上振蕩15分鐘，振蕩完成后將96孔板于酶標儀上在570nm波長處讀取光吸收值(0D570)。
[0084]1.6.2用流式細胞術檢測VSVMP/DPP復合物誘導SK0V3細胞的凋亡情況
[0085](1) SK0V3細胞接種6孔板方法詳見2.5.1
[0086](2)取2 μ g VSVMP質粒和空載P-VAX質粒分別稀釋于50 μ 1無血清無抗生素的DMEM培養基中，輕輕混勻。
[0087](3)取50 μ g制備好的DPP納米粒稀釋于50 μ 1無血清無抗生素的DMEM培養基中，輕輕混勻。
[0088](4)分別混合稀釋的VSVMP質粒、P-VAX質粒和DPP納米粒(總體積約130 μ 1)，注意將稀釋的基因加入到稀釋的材料中，室溫靜置30分鐘。
[0089](5)將6孔板中的培養基吸出，用PBS洗滌細胞2次，加無血清無抗生素的DMEM培養基1ml。
[0090](6)將130 μ 1的VSVMP/DPP復合物、P-VAX/DPP復合物加到孔板中，同時將130 μ 1體積的DPP材料和0.9% NS也加到孔板中，輕輕前后左右搖晃混勻。
[0091](7)換液孵育的方法詳見2.5.7
[0092](8)轉染完成后，將細胞收集于流式管中，用冷的PBS洗2遍，1500rpm 3分鐘離心，然后用100 μ 1結合緩沖液(binding buffer)重懸。
[0093](9)在100 μ 1細胞懸浮液中，加入5 μ 1 annexin V-FITC，再加入10 μ 1 PI試劑，用槍輕輕混勻，避光孵育15分鐘(參照B1legend公司annexin V-FITC/PI雙染試劑盒說明書進行)。
[0094](10)孵育完成后，行流式細胞術檢測治療組、空載組、材料組和生理鹽水組的SK0V3細胞的凋亡情況。
[0095]1.7檢測VSVMP/DPP復合物體內抗腫瘤能力
[0096](1)人卵巢癌裸鼠腹腔種植瘤模型的建立:購買6-8周齡的雌性裸鼠20只，飼養在本實驗室SPF級裸鼠房中。收集對數期生長的SK0V3細胞，用無血清無抗生素的DMEM培養基洗2遍，進行細胞計數，計數完成后用無血清無培養基的DMEM培養基制成細胞懸浮液。每只小鼠接種細胞量為1 X 107細胞，腹腔注射細胞懸浮液200 μ 1。
[0097](2)隨機分組:接種后的第3天，將裸鼠隨機分為4組，每組5只，分別為實驗組、空載組、材料組、生理鹽水組。
[0098](3)腹腔給藥:分別取5 μ gVSVMP質粒和P-VAX空載質粒稀釋于50%的葡萄糖溶液中(最終濃度為5% )，然后將稀釋的VSVMP質粒和P-VAX質粒加入到制備好的DPP納米粒溶液中，輕輕晃動搖勻，給藥體系為200 μ 1。制藥完成后，將VSVMP/DPP復合物溶液、EP/DPP復合物溶液、DPP納米粒溶液和生理鹽水溶液(200 μ 1)注射入小鼠腹腔內。
[0099](4)每3天給藥一次，共治療8次。
[0100](5)治療完成后2周，用頸椎脫位法將小鼠處死，解剖小鼠腹腔，收集腹腔腫瘤和腹水，稱量瘤重。
[0101]1.8統計學分析
[0102]實驗數據以平均數土標準誤來表示(mean土SD)，用SPSS17.0統計軟件進行數據分析，主要運用求均值、t檢驗進行均數比較分析。P〈0.05統計學有差異。
[0103]2 結果
[0104]2.1 DPP納米粒的特征
[0105]2.1.1 DPP納米粒的粒徑、電位和形態學
[0106]制備好的DPP納米粒在掃描透射電鏡下觀察形態學。在掃描透射電鏡下，DPP納米粒是大小較為均一的球型顆粒，直徑大小約45nm (圖4)。DPP納米粒的平均粒徑為73 土6nm，平均電位為+46±2mV。納米粒的粒徑分布和電位分布見圖3A、3B。
[0107]2.1.2 DPP納米粒與DNA的結合能力
[0108]我們用凝膠阻滯分析實驗檢測了 DPP納米粒的DNA結合能力，其結果見圖5。當DPP與DNA的質量之比為15:1的時候，DNA質粒可以被DPP納米粒完全結合。通過靜電相互作用，帶負電荷的DNA質粒被吸附在DPP納米粒的表面，形成DNA/DPP復合物。由于表面帶強大的正電荷，所以DPP納米粒可以有效地結合DNA質粒。所以，當DPP與DNA的質量之比為15:1時，DPP納米粒可以完全結合DNA。
[0109]2.2 DPP納米粒的細胞毒性檢測
[0110]為了檢測DPP納米粒的細胞毒性，我們將其與金標準轉染材料PEI 25K的細胞毒性進行比較。在293T細胞和SK0V3細胞中，PEI 25K對兩種細胞的毒性都很大，IC50<10 μ g/mL。而DPP納米載體對這兩種細胞的毒性要小很多，IC50>200 μ g/mL，結果見圖6A、6B。
[0111]2.3 DPP納米粒轉染293T細胞和SK0V3細胞
[0112]同樣，我們用DPP納米粒轉染了 293T細胞和SK0V3細胞，并與PEI 25K進行了比較，選取綠色熒光蛋白質粒(PGFP)作為報告基因。
[0113]將轉染后的293T細胞置于倒置熒光顯微鏡下觀察，可以看出絕大部分細胞發出較強的綠色熒光，表明DPP納米粒成功地將GFP質粒傳遞到了這些細胞中，結果見圖7A、7B。然后將細胞收集行流式細胞術檢測，從流式圖和統計結果中可以看出DPP納米粒的轉染率稍高于 PEI 25K 的轉染率(82.80±1.0% VS 78.96±0.9% )，結果見圖 7C、7D。
[0114]同樣，將轉染后的SK0V3細胞置于倒置熒光顯微鏡下觀察，可以看出大部分細胞發出了較強的綠色熒光，表明DPP納米粒成功地將GFP質粒傳遞到了這些細胞中，結果見圖8A、8B。然后將細胞收起行流式細胞術檢測，從流式圖和統計結果中均可以看出DPP納米粒的轉染率明顯高于PEI 25K的轉染率(72.25±3.2% VS 37.7±0.6% )，結果見圖8C、8D。從這些數據中可以看出，DPP納米粒是一種新型的非病毒基因載體，具有可降解性、細胞毒性低且轉染率高的特征，在基因治療中有潛在的應用前景。
[0115]