瘤小鼠模型。
[0129] TIDA建模方式具體操作見圖1。實驗組1、2的BALB/c小鼠，分別灌胃給予生理鹽 水、4. 5mg/Kg Rh2單體。在第4天分別在皮下注入LLC細胞（100uL，106細胞/只）建立腫 瘤小鼠模型。
[0130] 3.第14天取各組小鼠全血、脾臟中T細胞，使用美天旎⑶4+T細胞磁珠分選試劑 盒（德國美天旎生物技術公司提供）分選出CD4+T細胞。
[0131] 4.使用eBiosience Treg流式檢測試劑盒（由eBiosience公司提供）在流式細 胞儀上檢測各組小鼠全血和脾臟中Treg細胞的含量。
[0132] 具體操作步驟包括：
[0133] (1)細胞配置成106/ml的細胞懸液，用staining buffer懸浮細胞；
[0134] (2)取100ul細胞，標記Fc(lug/樣品）封閉15分鐘，4°C ;
[0135] (3)細胞標記CD4 (0· 125ug/樣品）和CD25 (0· 06ug/樣品）的抗體，4°C孵育30分 鐘；
[0136] (4)用staining buffer洗細胞，接著用固定破膜劑通透細胞膜30分鐘到18小 時，4。。；
[0137] (5)通透結束后用通透緩沖液洗細胞，標記Foxp3 (0. 5ug/樣品）的抗體4°C孵育 30分鐘；
[0138] (6)用通透緩沖液洗細胞后，staining buffer懸浮細胞，上流式機器檢測。
[0139] 采用LLC小鼠肺癌細胞建立了小鼠腫瘤模型，采用給藥期間植瘤（TIDA)的給藥方 式，各組分別給予安慰劑及Rh2后，檢測小鼠全血和脾臟中Treg細胞占 T細胞的比例。具 體結果如圖2和圖3所示。
[0140] 圖2A為小鼠全血中Treg流式細胞檢測結果圖。從圖2A可以看出，與正常小鼠（正 常）Treg比例（3. 20 % )相比，腫瘤小鼠（植入LLC細胞0mg/kg)的Treg比例（8. 23 % )明 顯升高，說明腫瘤小鼠全血中Treg數量顯著增加。再給予高劑量Rh2后，與腫瘤小鼠相比， 給藥組小鼠（植入LLC細胞4. 5mg/kg) Treg比例（4. 97% )大幅度降低，有顯著性差異，說 明Rh2在全血中可顯著抑制Treg數量。
[0141] 圖2B為小鼠全血中Treg含量統計結果柱狀圖。從圖2B可以看出，正常代表正常 小鼠，Omg/kg代表腫瘤小鼠，4. 5mg/kg代表給予Rh2的給藥組小鼠。與腫瘤組小鼠（Omg/ kg)相比，給藥組小鼠（4. 5mg/kg)全血中的Treg比例顯著降低，同時，給藥組小鼠 Treg比 例并不比正常組小鼠低，說明Rh2可以顯著抑制全血中Treg比例，使其盡量恢復到正常水 平。
[0142] 圖3顯示小鼠脾臟中Treg流式結果及Treg含量分析圖。
[0143] 圖3A為小鼠脾臟中Treg流式細胞檢測結果圖。從圖3A可以看出，與正常小鼠（正 常）Treg比例（14. 29 % )相比，腫瘤小鼠（植入LCC細胞Omg/kg)的Treg比例（22. 53 % ) 明顯升高，說明腫瘤小鼠脾臟中Treg數量顯著增加。再給予高劑量Rh2后，與腫瘤小鼠相 t匕，給藥組小鼠（植入LCC細胞4. 5mg/kg)Treg比例（16. 92% )大幅度降低，有顯著性差 異，說明Rh2在脾臟中可顯著抑制Treg數量。
[0144] 圖3B為小鼠脾臟中Treg流式統計結果柱狀圖。從圖3B可以看出，正常代表正常 小鼠，〇mg/kg代表腫瘤小鼠，4. 5mg/kg代表給予Rh2的給藥組小鼠。與腫瘤組小鼠（Omg/ kg)相比，給藥組小鼠（4. 5mg/kg)脾臟中的Treg比例顯著降低，同時，給藥組小鼠 Treg比 例并不比正常組小鼠低，說明Rh2可以顯著抑制脾臟中Treg比例，使其盡量恢復到正常水 平。
[0145] 綜上所述，與正常小鼠相比，腫瘤小鼠的全血和脾臟中的Treg比例都是明顯升高 的，說明腫瘤小鼠 Treg比例顯著增加。再給予高劑量Rh2后，給藥組小鼠 Treg比例大幅度 降低，幾乎到了和正常小鼠差不多的水平，Rh2對于降低Treg比例有顯著的效果。
[0146] 實施例3 :Rh2直接下調腫瘤小鼠 Treg細胞
[0147] 首先用人參皂苷Rh2單體處理腫瘤小鼠 CD4+T細胞；然后采用流式細胞分析方法 檢測Treg細胞的表達變化。
[0148] 1.細胞培養
[0149] LLC小鼠肺癌細胞（來源于中國科學院細胞庫）和Renca小鼠腎癌細胞（來源于 中國科學院細胞庫）傳代培養，消化收集用于小鼠腫瘤模型制備。
[0150] i.LLC小鼠肺癌細胞
[0151] 完全培養基，高糖DMEN，10 % FBS，4mmol/L谷氨酰胺，雙抗，在5 %的C02培養箱中 37°C培養。
[0152] ii. Renca小鼠腎癌細胞
[0153] 完全培養基，高糖DMEN，10% FBS，4mmol/L谷氨酰胺，雙抗，在5%的0)2培養箱中 37°C培養。
[0154] 2.小鼠建模
[0155] 選用BALB/c雄性小鼠（由南京大學模式動物研究所提供），建立腫瘤小鼠模型，分 為三組：
[0156] i.正常小鼠組：BALB/c小鼠皮下注射100uL生理鹽水；
[0157] ii.LLC肺癌腫瘤小鼠組：皮下植瘤LLC細胞（100uL，106細胞/只），2周后，觀察 到小鼠腫瘤明顯長出；
[0158] iii.Renca腎癌腫瘤小鼠組：皮下植瘤Renca細胞（100uL，106細胞/只），2周后， 觀察到小鼠腫瘤明顯長出。
[0159] 3.⑶4+T細胞的原代細胞培養
[0160] 使用美天旎CD4+T細胞磁珠分選試劑盒（德國美天旎生物技術公司提供）分選出 小鼠原代CD4+T細胞，進行原代細胞培養。
[0161] 原代細胞培養：采用 RPMI1640，12% FBS，4mmol/L 谷氨酰胺，lmmol/L HEPES，雙 抗，在5%的C02培養箱中培養，包被培養板中加入1 μ g/mL的小鼠⑶3e抗體，培養液中加 入1 μ g/mL的小鼠⑶28抗體。待細胞狀態穩定后，分別加入不同濃度的Rh2(0, 5,10, 20， 40ug/ml)，72小時后，收集細胞備用。
[0162] 4.使用eBiosience Treg流式檢測試劑盒在流式細胞儀上檢測各組小鼠全血和 脾臟中Treg細胞在T細胞中的比例。具體操作步驟如實施例1所述。具體結果如圖4和 圖5所示。
[0163] 從圖4可以看出；5、10、20、40代表不同濃度的Rh2給藥處理。與正常小鼠⑶4+T 細胞相比，腫瘤小鼠⑶4+T細胞中的Treg比例（12.41%，13.45% )明顯升高，在體外用不 同濃度的Rh2 (5,10, 20,40ug/mL)處理腫瘤小鼠的原代提取的CD4+T細胞，發現肺癌、腎癌 腫瘤給藥組小鼠 Treg比例（4. 97% )依次降低，說明Rh2直接抑制腫瘤小鼠 Treg細胞的比 例。
[0164] 在不同濃度的Rh2下，給藥后肺癌腫瘤小鼠 Treg比例依次降低，分別為9. 50%， 7. 58 %，6. 57 %及5. 69 % ;給藥后腎癌腫瘤小鼠的Treg比例依次降低，分別為9. 97 %， 6. 27 %，5. 25 %及3. 97 %，與空白對照正常小鼠相比，有顯著性差異。且給藥劑量越大，Treg 比例越低。
[0165] 從圖5可以看出，5、10、20、40代表不同濃度的詘2給藥處理。兩種腫瘤小鼠1^叫 細胞在T細胞中的比例遠遠高于正常小鼠，在體外用不同濃度的Rh2(0,5,10,20,40ug/mL) 處理腫瘤小鼠的原代提取的CD4+T細胞，發現隨著Rh2劑量的加大，肺癌腫瘤小鼠和腎癌腫 瘤小鼠 T細胞中高水平的Treg細胞的比例依次降低。
[0166] 與空白對照正常小鼠（Oug/mL)相比，不同劑量組（5，10,20,40ug/mL)Treg細胞的 比例顯著性降低，呈現一定的劑量依賴性。
[0167] 由此可見，Rh2可以直接作用于Treg細胞，降低Treg細胞在T細胞中的比例，且 對Treg細胞抑制作用效果呈濃度依賴性，隨之Rh2濃度的增加 Treg細胞在T細胞中的比 例降低。
[0168] 實施例4 :Rh2對小鼠 Treg細胞及腫瘤生長的影響
[0169] 用人參皂苷Rh2單體處理腫瘤小鼠（LLC肺癌腫瘤和Renca腎癌腫瘤），取血和脾 臟備用，采用流式檢測Rh2單體對小鼠脾臟和血液中的T細胞中Treg水平的影響，并通過 測量腫瘤體積，研究Rh2單體對腫瘤生長的影響。
[0170] 1.細胞培養
[0171] LLC肺癌細胞和Renca腎癌細胞傳代培養，消化收集細胞用于構建小鼠腫瘤模型。 具體培養方式如實施例2所述。
[0172] 2.小鼠建模
[0173] 選用BALB/c雄性小鼠（購自南京大學模式動物研究所），建立正常小鼠和腫瘤小 鼠的給藥模型，分為以下幾組，具體建模方式如圖6所示：
[0174] i.正常小鼠組：BALB/c小鼠皮下注射100uL生理鹽水，灌胃給予安慰劑（生理鹽 水），本組10只小鼠；
[0175] ii. LLC小鼠肺癌細胞植瘤-TIAA (給藥后植瘤）建模小鼠組：皮下植瘤LLC細胞 (100uL，106細胞/只）。采用給藥后植瘤（以下簡稱TIAA)建模方式，分別給予同等劑量 安慰劑（10只小鼠）、1· 5mg/Kg Rh2單體（10只小鼠）、4. 5mg/Kg Rh2單體（10只小鼠）；
[0176] iii. LLC小鼠肺癌植瘤-TIDA(給藥期間植瘤）建模小鼠組：皮下植瘤LLC細胞 (100uL，106細胞/只）。采用給藥期間植瘤（TIDA)建模方式，分別給予同等劑量安慰劑（10 只小鼠）、1· 5mg/Kg Rh2單體（10只小鼠）、4. 5mg/Kg Rh2單體（10只小鼠）；
[0177] iv. Renca小鼠腎癌植瘤-TIAA (給藥后植瘤）建模小鼠組：皮下植瘤Renca細胞 (100uL，106細胞/只）。采用TIAA建模方式，分別給予同等劑量安慰劑（10只小鼠）、
[0178] 1. 5mg/Kg Rh2 單體（10 只小鼠）、4. 5mg/Kg Rh2 單體（10 只小鼠）；
[0179] v. Renca小鼠腎癌植瘤-TIDA(給藥期間植瘤）建模小鼠組：皮下植瘤Renca細 胞（100uL，106細胞/只）。采用TIDA建模方式，分別給予同等劑量安慰劑（10只小鼠）、 1. 5mg/Kg Rh2 單體（10 只小鼠）、4. 5mg/Kg Rh2 單體（10 只小鼠）。
[0180] 3.每日定時測量小鼠腫瘤尺寸，并計算體積，體積計算公式為1/6X π X長X 寬X寬。
[0181] 4.處死小鼠后，提取小鼠全血和脾臟中Τ細胞備用。使用美天旎⑶4+Τ細胞磁珠 分選試劑盒（德國美天旎生物技術公司提供）分選出CD4+T細胞。
[0182] 5