人參皂苷Rh2在抑制Treg細胞中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物制藥技術領域，本發明提供了人參皂苷Rh2在抑制Treg細胞中的 應用及其制備方法。具體地，本發明公開了人參皂苷Rh2通過抑制Treg細胞，從而增強T 細胞抗腫瘤免疫反應并抑制腫瘤生長，以改善機體免疫功能的方法及應用。
【背景技術】
[0002] 腫瘤是目前危害人類健康最嚴重的疾病之一，據WHO統計，腫瘤已成為威脅人類 生命健康的頭號殺手。國內外對惡性腫瘤防治的研究投入了大量的人力、物力和財力，但至 今尚未取得根本性的突破。傳統的化學藥物治療和手術、放療等結合，雖然成功提高了多種 惡性腫瘤的治愈率，但是由于較強的副作用以及耐藥性，使得尋找新的治療腫瘤的研究刻 不容緩。
[0003] 中藥是中醫治病的物質基礎，中藥在治療癌癥中具有多方位、多靶點、不易產生耐 藥性等優勢，符合腫瘤多因素、多環節治病的機理，但是針對中藥抗腫瘤的有效成分的提取 及作用機理的研究，較難明確。
[0004] 人參為五加科植物人參的干燥根，《神農本草經》將人參列為上品，具有主補五臟， 安精神，定魂魄，止驚悸，除邪氣，明目開心益智，久服輕身延年的功效。人參主要化學成分 為人參皂苷、人參多糖和揮發油類。現代藥理與臨床研究表明，人參的活性成分具有誘導腫 瘤細胞凋亡、阻滯腫瘤細胞周期、抑制腫瘤細胞增殖，抑制腫瘤細胞的轉移和血管生長、降 低腫瘤細胞的多藥耐藥性。人參的主要活性成分為人參皂苷，人參皂苷按苷元不同可分為： 原人參二醇型（pro)、原人參三醇型（ppt)和齊墩果烷型（〇A)。人參中二醇型皂苷較三醇 型皂苷含量高。如人參皂苷Rbl、Rb2、Rc、Rd是白參中主要成分，而人參皂苷Rh2是紅參中 特有成分，白參中幾乎沒有。人參皂苷還對腫瘤細胞具有誘導分化作用，但其具體作用機制 尚不清。
[0005] 因此，本領域迫切需要了解人參皂苷在腫瘤治療領域的作用模式及應用價值，以 開發新的腫瘤治療藥物。
【發明內容】
[0006] 本發明提供了人參皂苷Rh2通過抑制Treg細胞從而抑制腫瘤的應用。
[0007] 本發明第一方面，提供了一種人參皂苷Rh2的用途，用于（a)制備抑制Treg細胞 的抑制劑；或（b)制備預防和/或治療Treg細胞升高性腫瘤的組合物。
[0008] 在另一優選例中，所述抑制Treg細胞包括抑制Treg細胞的分化、增殖、和/或表 達。
[0009] 在另一優選例中，所述的組合物包括藥物組合物、食品組合物和/或保健品組合 物。
[0010] 在另一優選例中，所述的組合物包括人參皂苷Rh2作為活性成分，和藥學上/食品 學上可接受的載體。
[0011] 在另一優選例中，所述人參皂苷Rh2d在70mg/kg · d的安全劑量內施用于哺乳動 物。
[0012] 在另一優選例中，所述的組合物通過選自下組的用藥方式進行給藥：口服、靜脈注 射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直腸灌注、鼻腔噴霧、口腔噴霧、皮膚局部或全身經皮用 藥；較佳地，所述的組合物通過口服或靜脈注射施藥。
[0013] 在另一優選例中，所述的組合物的制劑選自下組：片劑、膠囊劑、注射劑、顆粒劑、 噴霧劑。
[0014] 在另一優選例中，所述的組合物還含有任選的抗腫瘤藥物。
[0015] 在另一優選例中，所述的抗腫瘤藥物選自下組的一種或多種：烷化劑、抗代 謝物、葉酸類似物、嘧啶類似物、嘌呤類似物以及相關抑制劑、長春花堿類、表鬼白毒素 (epipodopyvllotoxins)、抗生素、L-天冬酞胺酶、拓撲異構酶抑制劑、干擾素、鉬配位復合 物、大黃素取代的脲、甲基肼衍生物、腎上腺皮質抑制劑、腎上腺皮質類固醇、孕激素、雌激 素、抗雌激素、雄激素、抗雄激素以及促性腺激素-釋放激素類似物。
[0016] 在另一優選例中，所述的人參皂苷Rh2包括：
[0017] 2〇(5)-人參皂苷他2:即2〇(5)-原人參二醇-3-〇-0-〇吡喃葡萄糖苷、2〇(1?)-人 參皂苷Rh2 :即20 (R)-原人參二醇-3-0-β -D吡喃葡萄糖苷、或其組合。
[0018] 在另一優選例中，所述20 (S)-人參皂苷Rh2的結構式如式I所示：
[0020] 在另一優選例中，所述的20 (R)-人參皂苷Rh2的結構式如式II所示：
[0022] 在另一優選例中，所述的人參皂苷Rh2通過以下步驟制備：
[0023] 將所述的植物莖葉總皂苷或原人參二醇組皂苷溶入有機酸或無機酸的水溶液或 醇溶液中，進行酸水解反應，然后收集反應物。
[0024] 在另一優選例中，所述的Treg細胞升高性腫瘤包括卵巢癌、乳腺癌、結直腸癌、胃 癌、肝癌、肺癌、腎癌、胰腺癌、淋巴瘤、黑色素瘤。
[0025] 在另一優選例中，所述的人參皂苷Rh2還用于制備治療Treg細胞升高造成的免疫 缺陷性疾病的藥物組合物。
[0026] 在另一優選例中，所述由于Treg細胞升高造成的免疫缺陷性疾病包括自身免疫 性胃炎、關節炎、腮腺炎、結腸炎、變態反應性腦炎和糖尿病。
[0027] 在另一優選例中，所述的Treg細胞升高指的是Treg細胞的總數或占 T細胞總數 白分比分別比正常人群Treg細胞的總數或占 T細胞總數百分比高一倍以上。
[0028] 在另一優選例中，本發明還提供了一種Treg細胞抑制劑組合物，所述的組合物含 有安全有效量的人參皂苷Rh2,和藥學上和/或食品學上可接受的載體。
[0029] 本發明第二方面，提供了一種體外非治療性的抑制Treg細胞的方法，在人參皂苷 Rh2存在下培養Treg細胞，或將人參皂苷Rh2與Treg細胞接觸，從而抑制Treg細胞。
[0030] 在另一優選例中，所述人參皂苷Rh2的濃度為0. 01-1000 μ g/ml，較佳地，為 5-500 μ g/ml，更佳地，為 20-200 μ g/ml。
[0031] 本發明第三方面，提供了一種體外非治療性的抑制Treg細胞升高性腫瘤的方法， 在人參皂苷Rh2存在下培養Treg細胞升高性腫瘤細胞，或將人參皂苷Rh2與Treg細胞接 觸，從而抑制Treg細胞升高性腫瘤。
[0032] 在另一優選例中，所述的腫瘤細胞來自以下一種或多種腫瘤：卵巢癌、乳腺癌、結 直腸癌、胃癌、肝癌、肺癌、腎癌、胰腺癌、淋巴瘤、黑色素瘤。
[0033] 本發明第四方面，提供了一種制備Treg細胞抑制劑的方法，將人參皂苷Rh2與藥 學上和/或食品學上可接受的載體混合，從而制備成Treg細胞抑制劑。
[0034] 在另一優選例中，所述的Treg細胞抑制劑還能進一步抑制Treg細胞升高性腫瘤。
[0035] 本發明第五方面，提供了一種抑制Treg細胞和/或抑制Treg細胞升高性腫瘤和 /或抑制Treg細胞升高引起的免疫缺陷性疾病的方法，包括步驟：（i)測定患有腫瘤和/或 自身免疫缺陷疾病的對象樣本中Treg細胞占 T細胞總數的比例VI ;和（ii)當VI > 2倍 正常值或對照值V0時，向所述的對象施用安全有效量的人參皂苷Rh2。
[0036] 在另一優選例中，所述的樣本為血液樣本，較佳地，為全血樣本。
[0037] 在另一優選例中，所述的對照值或正常值V0為正常無患病人群的Treg細胞占 T 細胞總數的比。
[0038] 在另一優選例中，所述需要的對象為哺乳動物，較佳地為小鼠、大鼠和人。
[0039] 在另一優選例中，所述安全有效量的人參皂苷Rh2的劑量為70mg/kg · d。
[0040] 應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0041] 圖1顯示TIDA建模方式。實驗組1、2的BALB/c小鼠，分別灌胃給予生理鹽水、 4. 5mg/Kg Rh2單體。在第4天分別在皮下注入LLC細胞（lOOuL，106細胞/只）建立腫瘤 小鼠模型。
[0042] 圖2顯示小鼠全血中Treg含量分析圖。圖2A顯示小鼠全血中Treg流式細胞檢 測結果圖。正常代表正常小鼠，植入LCC細胞Omg/kg代表腫瘤小鼠，植入LCC細胞4. 5mg/ kg代表給予Rh2的給藥組小鼠。圖2B顯示小鼠全血中Treg含量統計結果柱狀圖。正常代 表正常小鼠，〇mg/kg代表腫瘤小鼠，4. 5mg/kg代表給予Rh2的給藥組小鼠。
[0043] 圖3顯示小鼠脾臟中Treg流式結果及Treg含量分析圖。圖3A顯示小鼠脾臟中 Treg流式細胞檢測結果圖。正常代表正常小鼠，植入LCC細胞Omg/kg代表腫瘤小鼠，植入 LCC細胞4. 5mg/kg代表給予Rh2的給藥組小鼠。圖3B顯示小鼠脾臟中Treg流式統計結果 柱狀圖。正常代表正常小鼠，〇mg/kg代表腫瘤小鼠，4. 5mg/kg代表給予Rh2的給藥組小鼠。
[0044] 圖4顯示各個腫瘤模型小鼠 Treg細胞在不同濃度Rh2下的比例。正常代表正常 小鼠，LLC肺癌荷瘤小鼠 Oug/mL代表肺癌腫瘤小鼠，腎癌荷瘤小鼠 Oug/mL代表腎癌腫瘤小 鼠；5、10、20、40代表不同濃度的Rh2給藥處理。
[0045] 圖5顯示小鼠原代Treg細胞在不同Rh2濃度下比例變化圖。正常mice代表正常 小鼠，LLC肺癌荷瘤小鼠 Oug/mL代表肺癌腫瘤小鼠，腎癌荷瘤小鼠 Oug/mL代表腎癌腫瘤小 鼠；5、10、20、40代表不同濃度的Rh2給藥處理。
[0046] 圖6顯示小鼠的建模方式。分別為：正常小鼠組、LLC小鼠肺癌細胞植瘤-TIAA (給 藥后植瘤）建模小鼠組、LLC小鼠肺癌細胞植瘤-TIDA(給藥期間植瘤）建模小鼠組、Renca 小鼠肺癌細胞植瘤-TIAA (給藥后植瘤）建模小鼠組、Renca小鼠肺癌細胞植瘤-TIDA (給 藥期間植瘤）建模小鼠組。
[0047] 圖7顯示小鼠全血中Treg細胞的表達變化。圖7為正常小鼠、兩種建模方式下 LLC、Renca植瘤的四種模型小鼠，及建立在此基礎上的給藥組小鼠實驗結果，圖片標明這幾 組小鼠全血中Treg的變化。圖7A顯示小鼠全血中Treg細胞流式細胞檢測結果圖。正常 代表正常小鼠，植入LCC細胞Omg/kg代表肺癌腫瘤小鼠 ，Renca cell implantedOmg/kg代 表腎癌腫瘤小鼠；TIAA代表給藥后植瘤建模小鼠組，TIDA代表給藥期間植瘤建模小鼠組； 1. 5mg/kg、4. 5mg/kg代表Rh2給藥濃度。圖7B為小鼠全血中Treg細胞統計結果柱狀圖。 正常代表正常小鼠，植入LCC細胞Omg/kg代表肺癌腫瘤小鼠，植入腎癌細胞Omg/kg代表腎 癌腫瘤小鼠；TIAA代表給藥后植瘤建模小鼠組，TIDA代表給藥期間植瘤建模小鼠組；1. 5、 4. 5代表Rh2給藥濃度。
[0048] 圖8顯示正常小鼠、兩種建模方式下肺癌、腎癌植瘤的四種模型小鼠，及建立在此 基礎上的給藥組小鼠脾臟中Treg細胞的變化趨勢。圖8A顯示小鼠脾臟中Treg細胞流式細 胞檢測