中的另外15只注射肉毒桿菌毒素（Xeomin，德國）。
[0167] 在手術（procedure)后2周，證實所有的狗的迷走神經響應徹底消除，然后在 14. 7 ±1. 5周Xeomin組全部恢復至基線值，以及在20. 1±1. 8周殼聚糖+肉毒桿菌毒素組 全部恢復至基線值（P〈〇.05 ;(圖5))。在2周時，誘導AF的刺激的閾值，分別地，在Xeomin 組中從基線處的4. 9±0. 6V增長至12. 4±2. 5V，以及在殼聚糖+肉毒桿菌毒素組中從基線 處的5. 6±1. 2V增長至16. 3±2. 2V(p〈0. 05)。沒有手術相關的并發癥發生。
[0168] 這些數據表明，通過心內途徑注射肉毒桿菌毒素至心肌內GPs以及心外膜脂肪墊 是可行且安全的，并提供心臟迷走神經響應的徹底消除以及顯著的AF抑制。殼聚糖+A型 肉毒桿菌毒素組合物（I:1. 76XIO7)比商業的A型肉毒桿菌毒素制劑（Xeomin，德國）更有 效且具有更長的持續作用。
[0169] 實施例13:使用殼聚糖+A型肉毒桿菌毒素組合物（I:4. 4XlO7)，殼聚糖+A型肉 毒桿菌毒素組合物（I:1. 76XIO7)以及商業的肉毒桿菌毒素制劑抑制動脈性高血壓的效果 和安全性
[0170] 現有的體外研究表明，注射肉毒桿菌毒素至大鼠腎臟中抑制活性腎素的釋放以及 導致血壓的降低（Mendezetal.，2013,Am.J.Physiol.Renal.Physiol. 304:F498_F504) 〇 本研究的目的在于對比使用本發明的制劑尤其是殼聚糖+A型肉毒桿菌毒素（本發明的制 劑N2 1，1 :4. 4XIO7)、殼聚糖+A型肉毒桿菌毒素（本發明的制劑N2 2,1 :1. 76XIO7)以及商 業的肉毒桿菌毒素制劑（Xeomin，德國）將肉毒桿菌毒素灌注至腎動脈以預防動脈性高血 壓的效果和安全性。
[0171] 在9只豬中，靜脈導管必然地穿過左腎動脈和右腎動脈。每只豬的腎臟通過腎內 灌注給藥肉毒桿菌毒素（50U/mL)(組合物N2 1 :3只豬；組合物N2 2 :3只豬；商業的肉毒 桿菌毒素制劑：3只豬）。安慰劑組中的3只豬用ImL的生理鹽水（0.9%氯化鈉的鹽水） 灌注至每只豬的腎動脈。所有的方案均經動物護理和使用委員會的機構（Institutional AnimalCareandUseCommittee)批準，符合實驗室動物護理和使用規則。在手術后I周，所有的腎臟均被移植出。將腎臟去膜并且均質。將獲得的細胞在含有lOOU/mL青霉素、 100 1^/11^鏈霉素以及5%胎牛血清的溶液中于37°(：/5%〇)2下在的聚-0-賴氨酸涂覆的 板中（0.lmg/mL)進行孵育。細胞通過使用含有lOOU/mL青霉素和100yg/mL鏈霉素的無血 清溶液更換培養液被除去血清2h。通過使用毛喉素（forskolin) (10以11)+3-異丁基-1-甲 基黃嘌呤（0. 5mM)Ih以增加細胞內cAMP的水平來刺激腎素的釋放lh。在處理之后，將培養 液離心以除去細胞碎片。收集上層清液于新離心管中，并在_20°C保存至處理。通過使用試 劑腎素-酶聯免疫吸附試劑盒（reagentReninELISAkit) (R&DSystems，USA)對上清液 中刺激的腎素含量進行分析。
[0172] 在灌注手術后的1周的末尾，在上清液樣本中測定了腎素濃度（％)的以下平均 值 ：本發明的制劑燦1:(1:4.4\107)-2.8±0.5% ;本發明的制劑燦2，，（1:1.76\107)-1.5±0. 2%，商業的肉毒桿菌毒素制劑（Xeomin，德國）-4. 2±1.2% ;安慰劑組（0. 9%氯 化鈉的鹽水）-4. 8±1. 4%。沒有手術相關的并發癥發生。
[0173] 這些數據表明灌注肉毒桿菌毒素至腎動脈以用于預防動脈性高血壓是可行且安 全的，并且顯著地降低了血壓升高過程中關鍵酶-腎素的釋放。殼聚糖+A型肉毒桿菌毒素 的組合物N2 2(1 :1. 76XIO7)比殼聚糖+A型肉毒桿菌毒素的組合物N2I(I:4. 4XIO7)以及 商業的A型肉毒桿菌毒素制劑（Xeomin，德國）更有效。
[0174] 實施例14:具有不同的毒素與殼聚糖的重量比的殼聚糖和肉毒桿菌毒素的組合 物的效果
[0175] 在研究殼聚糖+肉毒桿菌毒素的最佳比例時，允許根據注射位置改善肉毒桿菌毒 素作用效果的特征被公開。對于更高含量的殼聚糖，組合物的延長釋放功能占優勢。更高 含量的殼聚糖對于組合物給藥至脂肪組織是合適的，其中，肉毒桿菌毒素的治療濃度能夠 通過緩慢釋放而達到。
[0176] 相反，當組合物被給藥至如腎動脈和心室肌的目標區域中時，這些區域與血液供 應系統存在直接聯系，這要求快速地達到治療濃度以及增加與肉毒桿菌毒素的接觸。這種 需求通過減少殼聚糖的質量比來滿足，這反過來又導致組合物的粘接功能占優勢。
[0177] 如圖3中所示，當制劑中的殼聚糖的濃度增加時，即當組合物中的肉毒桿菌毒素 與殼聚糖的重量比降低（從I:1.76X107(Ne2)至I:4.4X107(N2 1))時，肉毒桿菌毒素 的釋放比率以及圖譜（profile)也改變了，并且相應的，靶向位置的有效性也改變了，而作 用持續時間有輕微變化。然而，其有效性仍為商業的肉毒桿菌毒素制劑的有效性的兩倍。
[0178] 當進行心內膜心肌注射時，相對于在心外膜脂肪墊中的肉毒桿菌毒素注射，肉毒 桿菌毒素要稀釋更多倍。據此，殼聚糖+肉毒桿菌毒素的心外膜注射需要另一種濃度比（接 近于I:4. 4XIO7)，這允許獲得更好的有效性和減少嚴重不良事件的風險，然而心內膜心肌 注射需要接近于I:1. 76XIO7的濃度比以允許獲得在靶向位置中獲得治療濃度。
[0179] 該事實通過比較根據實施例12中所描述的手術的I:4. 4XIO7和I:1. 76X10 7 的濃度比的效果進行了確認。在手術后的第2周，所有的狗表現迷走神經響應被徹底消 除。在第2周，分別地，誘導AF的刺激的閾值在濃度比為I:4. 4XIO7的組中從基線處的 5. 1±0. 8V增加至了 8. 3±3.IV，在濃度比為I:1.76X107的組中從基線處的4. 9±1.IV增 加至了 15. 8±2. 4V(p〈0. 05)。
【主權項】
1. 一種組合物，該組合物含有肉毒桿菌神經毒素和選自由殼聚糖和那曲肝素所組成的 組中的黏多糖，以及藥學上可接受的賦形劑；其中，肉毒桿菌神經毒素與黏多糖的重量比為 約 1 :103 至約 1 :109。2. 根據權利要求1所述的組合物，其中，所述黏多糖為殼聚糖。3. 根據權利要求2所述的組合物，其中，所述殼聚糖具有約IOOkDa至約1000 kDa的平 均分子量（Mw)。4. 根據權利要求2或3所述的組合物，其中，所述殼聚糖具有約85%至約100%的脫乙 酰度。5. 根據權利要求1-4中任意一項所述的組合物，其中，肉毒桿菌神經毒素與黏多糖的 重量比為約1 :1〇6至約1 :1〇8。6. 根據權利要求1-4中任意一項所述的組合物，其中，肉毒桿菌神經毒素與黏多糖的 重量比為約I:1. 5XIO7至約I:5X10 7。7. 根據權利要求1-6中任意一項所述的組合物，其中，所述肉毒桿菌神經毒素為A型肉 毒桿菌神經毒素。8. 根據權利要求1-7中任意一項所述的組合物，其中，該組合物中含有以下成分： A型肉毒桿菌毒素 l-200U/mL 黏多糖 0?l_50mg/mL 鹽水 0?l_50mL。9. 根據權利要求1-8中任意一項所述的組合物，其中，該組合物含有約20-200UI的肉 毒桿菌毒素。10. 根據權利要求1-9中任意一項所述的組合物，其中，所述組合物用作藥劑。11. 根據權利要求1-9中任意一項所述的組合物，其中，所述組合物為藥物制劑。12. 根據權利要求11所述的組合物，其中，所述組合物為可注射的制劑。13. 根據權利要求1-12中任意一項所述的組合物，其中，所述組合物進一步含有至少 一種I類、II類或III類的抗心律失常藥物。14. 根據權利要求1-13中任意一項所述的組合物在預防和/或治療心律失常或動脈性 高血壓中的應用。15. 根據權利要求14所述的組合物的應用，其中，所述組合物用于預防或治療心房纖 維性顫動。16. 根據權利要求14-15中任意一項所述的組合物的應用，其中，所述組合物被給藥至 心肌內的GPs、心外膜脂肪墊或腎動脈。17. -種預防和/或治療受試者心律失常，特別是心房纖維性顫動或動脈性高血壓的 方法，該方法包括在需要的所述受試者中給藥根據權利要求1-13中任意一項所述的藥物 制劑。18. 根據權利要求17所述的方法，其中，所述組合物被給藥至心肌內的GPs、心外膜脂 肪墊或腎動脈。19. 根據權利要求18所述的方法，其中，所述組合物以50UI/mL的劑量在至少一個心外 膜脂肪墊中進行給藥。20. 根據權利要求17-19中任意一項所述的方法，其中，所述組合物與至少一種I類、 II類或III類的抗心律失常藥物聯合給藥。21. -種藥用試劑盒，該藥用試劑盒包括隔室形式的第一室或一系列室以及第二室或 一系列室，其中，第一室或一系列室包括根據權利要求1-13中任意一項所述的組合物，第 二室或一系列室包括具有使用說明書的注射用注射器。22. -種用于制備根據權利要求1-13中任意一項所述的組合物的藥用試劑盒，該藥用 試劑盒包括隔室形式的第一室或一系列室以及第二室或一系列室，其中，第一室或一系列 室包括肉毒桿菌毒素溶液，第二室或一系列室包括具有使用說明書的殼聚糖粉末和任選的 用于制備制劑的小瓶。
【專利摘要】本發明涉及含有肉毒桿菌毒素和黏多糖的藥物組合物及其應用，該藥物組合物具有增強的藥理活性和持久的肉毒桿菌毒素效果。
【IPC分類】A61K47/36, A61K9/00, A61K38/00
【公開號】CN105209014
【申請號】CN201480027168
【發明人】E·波庫謝洛夫, V·福緬科, N·薩拉赫迪諾夫
【申請人】波斯蒂貿易有限公司
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2014年5月14日
【公告號】CA2911046A1, EP2996674A1, US20160114013, WO2014184746A1