及500mg的 殼聚糖）。結果得到的液體藥物組合物含有以下成分：
[0120] A型肉毒桿菌毒素 10IU/mL(0. 25ng/mL)
[0121] 殼聚糖 50mg/mL
[0122] 鹽水 多至IOmL。
[0123] 實施例8 :含有A型肉毒桿菌毒素和透明質酸鈉的藥物組合物的制備（不是本發 明的對比例）
[0124] 通過在ImL的配有系統Luer-LokTip的注射器中混合100yL的A型肉毒桿菌毒 素溶液（含有20U或0.5ng的A型肉毒桿菌毒素）和400iiL的1%的透明質酸鈉（含有 4mg的透明質酸鈉，Sigma-aldrichcat#53747)以制備藥物組合物。結果得到的液體藥物 組合物含有以下成分：
[0125] A型肉毒桿菌毒素 20U/mL(0. 5ng/mL)
[0126] 透明質酸鈉 lOmg/mL
[0127] 生理鹽水 補足0. 5mL體積。
[0128] 實施例9 :獲得的藥物組合物的生物測試
[0129] 本發明的藥物組合物（N2 1-6)的有效性和安全性測試與相同劑量（以單位表示） 的溶于鹽水的A型肉毒桿菌毒素的商業制劑溶液以及與相同劑量（以單位表示）的含有A型肉毒桿菌毒素和其它非殼聚糖和肝素（N2 3和4)的黏多糖的藥物組合物溶液進行比較。
[0130] 這項研究在《良好實驗室操作（GoodLaboratoryPractice)》的框架下進行（與 動物處理的法律和道德標準相一致），并且在當地倫理委員會批準下進行。每項實驗采用兩 組10只實驗動物，Wistar大鼠。每組在右大腿中注射用0.9%的氯化鈉溶液（鹽水）稀釋 的A型肉毒桿菌毒素；藥物組合物（N2 1-6)在左大腿進行給藥。
[0131] 麻醉：乙醚
[0132] 注射體積：每條大腿0? 5mL。
[0133] 給藥方法：肌內注射，三個注射點（大腿的背部、大腿的內側（medial)、大腿的外 側），每處〇. 16mL。
[0134] 制劑的比較通過評價大腿肌肉響應電刺激的降低進行。在整個時間進程中比較 肌內電刺激的閾值最小變化。電刺激閾值的測量通過在肌內使用兩個無菌鋼微電極和ERA 300設備（Biotronic，USA)進行。在測量過程中，這些微電極以約4mm的深度被臨時肌內 插入至大鼠大腿的外側區，各個電極彼此相距l〇mm。例如，如果組合物N2 1的肌內電刺激的 最小閾值為4. 0±0. 2V，并且對照組的為2. 0±0. 12V，那么組合物Ne1在測量時的生理效應 相對于肉毒桿菌毒素商業制劑的生理效應增加了 2倍。
[0135] 在注射之前，在不同組的實驗動物中觀察到整體的高活性（在鼠籠中的活動）。
[0136] 在注射程序后的第一天，將動物暴露在用于鎮靜的藥物的殘留氛圍中。
[0137] 在注射一周之后，觀察到在所有大鼠中下肢癱瘓，但是上肢可以運動（肉毒桿 菌毒素作用的臨床證據）。組合物的肌內電刺激的最大閾值為：N2I:4. 0±0.IV(對照 組為 2.5±0.IV，初值為 1.5±0.IV)，Ne2 :10.0±0.4V(對照組為 3.0±0.IV，初值為 1. 0±0.IV) 〇
[0138] 在注射兩周之后，觀察到在所有大鼠中下肢癱瘓，但是上肢可以運動。大鼠體重降 低，并且表現出厭食和厭水。組合物的肌內電刺激的最大閾值為：N2I:6. 0±0. 3V(對照組 2. 5±0. 2V)，N2 2 :10. 0±0. 5V(對照組 2. 3±0. 1)。
[0139] 在注射3周之后，觀察到在所有大鼠中下肢癱瘓，但是上肢可以運動。大鼠活動 的力度增加。它們活躍地喝水并且正常進食。組合物的肌內電刺激的最大閾值為：N2I: 4.0±0.IV(對照組 2.0±0.lV)，Ne2 :5.0±0.2V(對照組 1.8±0. 1)。
[0140] 在注射4周之后，大鼠客觀地（objectively)活躍并且僅有下肢（lower extremities)仍然觀察到癱瘓。組合物的肌內電刺激的最大閾值為：NsI:4. 0±0. 2V(對 照組 2. 0±0. 12V)，N2 2 :5. 0±0. 3V(對照組 2. 0±0. 2)。
[0141] 組合物N2 3-6,在注射后的第一周沒有觀察到最大效果，但是在第二周觀察到了； 但是，與對照組的差異的絕對值不像殼聚糖情況下那樣大。因此，在第二周，對比組合物 N2 3.的肌內電刺激的最大閾值為1.8±0. 1V(對照組2. 3±0.IV，初值為1.0±0.IV)， 組合物Ne5 :2. 2±0. 1V(對照組1.5±0.IV，初值為1.2±0.IV)以及對比組合物Ne11 : I. 5±0.IV(對照組 2. 6±0. 2V，初值為 1±0.IV)。
[0142] 相比于商業制劑，可能肝素相當牢固地持有A型肉毒桿菌毒素以防止它的生物效 應，然而相反，低分子那曲肝素加強了肉毒桿菌毒素的作用。它還進一步地通過對比制劑4 顯著效果的缺失（與本發明的制劑N2 6相比）得到了支持。
[0143] 本發明的組合物的潛在毒性通過對實驗動物的內部器官進行組織學檢測的組織 形態學研究進行評價。通過顯微分析福爾馬林固定的以及用石蠟包埋的肝、腎、脾、心、骨骼 肌和腦的組織樣本，沒有發現病變的形態學信號。因此，結論為測試劑量下的A型肉毒桿菌 毒素以及本發明的藥物組合物在實驗動物的組織和器官上沒有損害性影響。
[0144] 實施例10 :通過注射含有A型肉毒桿菌毒素的藥物組合物至心外膜脂肪墊以抑制 心房纖維性顫動的誘導的研究
[0145] 該測試使用藥物組合物N2 2.在包括10只狗的小組中進行，含有左心房的右中心 神經節叢的心外膜脂肪墊通過右側開胸進行分配（allocated)。
[0146] 在實驗組（5只狗）中，在兩個右側脂肪墊中分別引入ImL的50U的A型肉毒桿菌 毒素+殼聚糖（100單位的A型肉毒桿菌毒素2mL，組合物N2 2)的溶液。在對照組（5只狗） 中，在兩個脂肪墊中分別引入ImL的50單位的A型肉毒桿菌毒素+0. 9%的氯化鈉（100IU 的A型肉毒桿菌毒素2mL)。
[0147] 在注射1、2、3和4周之后，使用或不使用頸迷走神經刺激評價電生理效應。通過 頸迷走神經刺激，在兩組狗中均出現心房纖維性顫動。這一效應通過在兩組中以如上描述 的劑量和區域給藥肉毒桿菌毒素測試溶液和肉毒桿菌毒素對照溶液而被阻斷。在對照組 中，在注射后的第8天（觀察期間）迷走神經的阻斷效應消失。在實驗組中，注射后，迷走 神經的阻斷效應持續超過30天。因此，通過使用本發明的組合物N2 2將肉毒桿菌毒素注射 至左心房的心外膜脂肪墊，頸迷走神經刺激誘導的心房纖維性顫動的臨時抑制延長至超過 30 (不少于4倍）天。
[0148] 這些結果表明使用本發明的A型肉毒桿菌毒素藥物組合物能夠增加毒素的藥理 學活性并且降低必要的單一劑量以實現期望的治療效果，這將允許降低肉毒桿菌毒素的副 作用。組合物N2 6.獲得了相似的結果，對比制劑4和對比制劑11不能實現該效果（圖1)。
[0149] 實施例11:本發明的組合物的效果與二糖組合物的效果的對比
[0150] 本發明的含有肉毒桿菌毒素和殼聚糖（N2 2)藥物組合物與含有二糖的注冊的商 業組合物（對比制劑N2 11)的有效性和持續性效果的對比按照如下進行以及。對比制劑 Ne11含有：
[0151]a)A型肉毒桿菌神經毒素（20U/mL(0. 5ng/mL))
[0152]b)穩定性藥劑吐溫80 (0? 02體積％ )
[0153] c)濃度為20mM的蔗糖
[0154]d)維持pH為5. 5-7. 5的組氨酸緩沖液
[0155]e)生理鹽水（0. 9 %氯化鈉的鹽水）加至體積為0. 5mL。
[0156] 在注射后，大鼠大腿肌肉的肌內電刺激的閾值采用前述方法測量。
[0157]組1-制劑Ne2
[0158] 組2-對比制劑Ne11
[0159] 結果如圖2所示：組1和組2的肌內電刺激的最大閾值分別為：組I:9. 8±0. 3V， 初值I. 2±0.IV，組 2 :2. 6±0.IV，初值L0±0.IV。
[0160] 2 周之后：組I:10.0±0.4V，組 2 :2.5±0.IV。
[0161] 4 周之后：組I:5. 0±0. 2V，組 2 :2. 0±0.IV。
[0162] 6周之后：組I:3. 3±0. 2V;組2中的刺激閾值降低至接近初值（I. 5±0.IV)。
[0163] 這些數據支持了本發明的含有殼聚糖和肉毒桿菌毒素的制劑比注冊的含有二糖 和肉毒桿菌毒素的商業組合物（如專利RU2407541中所述的）顯示出更好的效果和更長的 持續作用。
[0164] 實施例12 :使用殼聚糖+A型肉毒桿菌毒素的組合物（I:1. 76XIO7)和商業制劑 肉毒桿菌毒素抑制誘導性心房纖維性顫動的有效性和安全性
[0165] 前述的動物研究表明，注射肉毒桿菌毒素至心外膜脂肪墊能夠抑制誘導性心房纖 維性顫動（AF)。本研究的目的在于比較使用殼聚糖+A型肉毒桿菌毒素（I:1. 76X107)(本 發明的制劑N2 2)和肉毒桿菌毒素的商業制劑將肉毒桿菌毒素心內注射至心外膜脂肪墊以 及心肌內的左心房神經節叢（GP)以預防AF的效果和安全性。
[0166] 在30只狗中，靜脈導管通過左心房。通過高頻刺激（HFS)誘發的迷走神經反射的 位置被標記在電解剖標測系統（electroanatomicmappingsystem)上，并且隨后用于指定 注射。肉毒桿菌毒素的心肌內注射（每只10U/0. 2毫升）在每只狗的7個位置處進行給 藥。另外，每只狗也通過心內途徑3次注射至含有前右、右下和左上GP(每處50U/lmL)的 心外膜脂肪墊（圖4)。在注射之前評價通過誘導性HFS和AF引起的迷走神經反射，以及 注射后每2周進行評價，直到標記在之前記錄的圖中的GP位置上通過精密導管復位以及 刺激使得所有的變化回到基線。30只狗中的15只注射殼聚糖+肉毒桿菌毒素組合物（1 : 1.76X107)，30只狗