的三天內，整體視網膜的DLK水平以接 近1.5倍增加（圖lb，e)。在從視神經分離的樣品中，DLK水平的增加僅在近端側發生而在 遠端軸突中不發生（圖lc，d)。在每種情況下，DLK水平在遠早于神經元變性開始前的時間 點增加，所述神經元變性在NGF去除后16天和在視網膜神經擠壓后3-7天開始。
[0195] DLK蛋白量的增加伴隨著~5kDa(圖If)的DLK表觀分子量的增加（圖la，b，d)。 用A蛋白磷酸酶處理DRG裂解產物以切割磷酸根基團使+NGF和-NGF條件下DLK的分子 量相等（圖lg)，表明，迀移率位移是磷酸化的結果。在視網膜神經擠壓中，DLK僅在RGC's 中被磷酸化并且在其它視網膜細胞類型中不被磷酸化（圖8a)。
[0196]在一些情況中觀察到DLK遷移率位移（Xu，Z.，Maroney，A. C.，Dobrzanski，P.， Kukekov, N.V. & Greene, L. A. Molecular and cellular biology21,4713-4724(2001)； Mata，M?等人The Journal of biological chemistry271，16888-16896(1996))，但是在其 它情況中沒有觀察到，并且當已經觀察到它時，該現象的基礎尚未被很好地了解。這些相矛 盾的結果可能至少部分由于跨研究組使用的SDS-PAGE緩沖液條件的不同（圖8b)。
[0197] 實施例2-響應營養因子去除，DLK蛋白被穩定
[0198] 解釋應激-誘導的DLK水平上升的可能機制包括：（1)增加的Dlk轉錄，⑵增加 的蛋白翻譯，或（3)增加的DLK穩定性。至于可能性1，進行實時qRT-PCR以定量經歷營養 因子去除的DRGs和神經擠壓的視網膜中DLK轉錄本的量。兩種條件均不顯示與未應激對 照相比可檢測的DLK轉錄本水平的改變（圖2a)，表明DLK蛋白水平的上升是由于轉錄后機 制。為了確定DLK穩定性是否受神經元應激影響，在存在或不存在NGF的情況下經8小時 的時期將DRGs用放線菌酮處理以抑制蛋白翻譯，并且確定該時期保留的DLK量。NGF去除， 觀察到DLK穩定性的~2. 5-倍增加（圖2b-c)，表明DLK蛋白水平的上升是響應神經元應 激的增強的蛋白穩定性的結果。
[0199] 為了進一步研究磷酸化在DLK的應激依賴性的調節中的作用，將未應激的在NGF 的存在下培養的DRGs用大田軟海綿酸（廣譜磷酸酶抑制劑）處理，以增強DLK磷酸化。該 處理足以增加DLK的表觀分子量和總水平，提示DLK的磷酸化調節蛋白穩定性（圖2d)。用 MG132處理產生DLK水平的增加，而不產生DLK磷酸化的增加，提示非磷酸化的DLK通常由 蛋白酶體降解（圖2d)。
[0200] 實施例3-神經元應激通過調節Phrl來調節DLK泛素化
[0201] 為了確定神經元應激是否降低DLK泛素化以增強DLK穩定性，從+NGF和-NGF DRGs免疫沉淀泛素化的蛋白，并且發現DLK泛素化在-NGF條件下顯著降低（圖3a)。在無 脊椎動物系統中，E3泛素連接酶（PAM/highwire/RPM-1)的PHR家族調節DLK蛋白水平并且 已經證明了fatfacets基因（編碼去泛素化酶（DUB))和dlk同源物之間的遺傳相互作用 (Collins，C.A.，Wairkar，Y.P.，Johnson，S.L. &DiAntonio,A. (2006) ;Nakata，K?等人 (2005) ;Xiong，X.等人（2010))。然而，因為來自PhrlKO小鼠胚胎的全腦裂解產物在DLK 蛋白量上未顯不出改變（Bloom，A.J.，Miller，B.R.，Sanes，J.R. &DiAntonio，A. (2007))， 因此，不清楚在脊椎動物中是否存在相似的通路以調節DLK。為了直接研究泛素蛋白酶體系 統在哺乳動物神經元中調節DLK水平的作用，培養在這兩種基因的小鼠同源物中缺失功能 等位基因的DRGs。
[0202] 培養來自USP9X(最接近fatfacets的小鼠同源物）的條件小鼠敲除的第一 DRGs。如對于敲除DUB(控制DLK周轉）所預期的，相對于Cre-DRGs，在缺少USP9X的 DRGs(Cre+)中觀察到DLK水平~35%的降低（圖3b，c)。然而，在敲除USP9X對DLK的基 礎水平具有影響的同時，Cre-神經元中DLK蛋白量的-NGF:+NGF比例幾乎與Cre+神經元 中的相同（圖3c)。與該觀察結果一致，與泛素乙烯基砜交聯，揭示USP9X活性不由NGF去 除改變（圖9)。因此，我們得出結論，USP9X將DLK去泛素化，但是對于DLK水平的應激依 賴性改變而言不需要。
[0203] 相反，對于失去功能Phrlmag等位基因的純合的DRGs(Lewcock，J.W.等人（2007))， 與野生型對照相比，在NGF的存在下呈現DLK水平的增加，同時在NGF去除后不影響DLK水 平，導致應激的和未應激條件下大致相當的DLK水平（圖3d，e)。此外，Phrlmag純合神經元 具有更低的泛素化DLK數量（圖3f)。這些觀察結果與在神經元應激情況下觀察到的DLK泛 素化降低（圖3a) -起，提示DLK泛素化的改變至少部分由于Phrl活性的調節或其與DLK 的相互作用。然而，Phrra4$經元中DLK量的增加不足以驅動下游信號傳導和下游靶點比 如c-Jun的磷酸化。因此，單獨升高的DLK不足以誘導下游信號傳導事件并且對于DLK激 活需要另外的輸入。
[0204] 實施例4-對于DLK穩定化，需要DLK活性和JNK活性
[0205] 神經元應激通過降低的泛素化導致DLK磷酸化和穩定化，并且大田軟海綿酸處理 也引起DLK磷酸化和穩定化。這提示DLK磷酸化和DLK穩定化之間可能的關聯。為了確 定磷酸化可能怎樣調節DLK蛋白穩定性，檢測通過瞬時轉染的Flag-標記的鼠DLK在HEK 293T細胞中的表達。293T細胞中表達的野生型DLK是組成型活性的，因為其二聚化且自 身磷酸化（Mata，M.等人（1996))。為了在一定程度上模擬神經元中未應激的相對于應激 的條件，通過突變我們通過與MLK3的同源性鑒定的推定的激活環中的磷酸化位點來制備 DLK的激酶失活版本（Leung，I.W. &Lassam，N.TheJournalofbiologicalchemistry276,1961-1967(2001))。一個這種點突變體，DLKS3°2A，當表達時不能引起c-Jun的磷酸化， 確認其缺少激酶活性。有趣的是，0〇(53(^在HEK293T細胞中比野生型DLK更低水平表達。 與USP9X共表達增加DLKS3°2A的表達至野生型水平，提示觀察到的更低蛋白水平是由于失活 DLK的增加的泛素化（圖4a)。這些數據與我們在神經元中的觀察結果一致。為了確認在 DLKS3°2A的情況下觀察到的蛋白表達的降低是激酶活性的喪失的結果而不是該特定突變的 效應，將具有僅含有DLK亮氨酸拉鏈的截短的構建體的野生型DLK(其用作防止全長DLK二 聚化的顯性陰性）（Nihalani，D.，Merritt，S. &Holzman，L.B.TheJournalofbiological chemistry275,7273-7279(2000))共轉染。類似于對于DLKS3°2AP；f觀察到的，與GFP共表達 DLK相比，DLK活性的降低導致降低的DLK表達（圖4b)。
[0206] 因為DLK通路活性似乎對于蛋白穩定化是必要的，檢測下游信號傳導是否在DLK 穩定性中起作用。使用以可由強力霉素誘導的方式表達DLK的穩定細胞系并且將細胞用兩 種結構上不同的JNK抑制劑處理（圖4c)。兩種JNK抑制劑都能降低DLK蛋白水平。
[0207] 為了確定該研究結果在神經元系統中的相關性，使用siRNA敲低JNK2敲除DRGs 中的JNK3表達，去除調節大多數應激誘導的神經元變性的兩種JNK家族成員（Coffey， E.T.等人TheJournalofneuroscience：theofficialjournaloftheSocietyfor Neuroscience22,4335-4345(2002) ;Chang，L. ，Jones，Y. ，Ellisman，M.H. ，Goldstein， L.S. &Karin，M.Developmentalcell4, 521-533 (2003))。與對照siRNA相比，盡管也觀 察到DLK表觀分子量的一些改變，JNK3敲低減弱了DLK的增加（圖4d)。假定盡管還發生 了其它JNK獨立的磷酸化事件，JNK活性產生反饋機制，導致對于DLK穩定化所需的DLK上 特定位點的磷酸化。在視網膜神經擠壓模型中，與同窩動物對照相比，在擠壓后18小時時， JNK2/3雙敲除不顯示DLK水平或分子量的增加（圖4e，箭頭），表明DLK的JNK-依賴性的 磷酸化也在成體體內損傷的范例中發生。
[0208] 實施例5-DLK穩定化所需磷酸化位點的鑒定
[0209] 為了鑒定DLK上功能上相關磷酸化位點，使用質譜法聯合細胞培養中氨基酸同位 素標記（SILAC)。對于這些研究，將表達FLAG-標記的DLK的293T細胞培養在含有賴氨 酸（13C615N2)和精氨酸（13C615N4)的同位素富集（重）型或其未標記對應物（輕）的SILAC 培養基中。建立四個成對條件（輕相對于重）以詳細分析JNK和DLK活性對DLK的整體 豐度和DLK磷酸化程度的影響：1)野生型（WT)DLK相對DLKS3°2A，2)DLKS3°2A相對與組成型 活性的JNK構建體共表達的DLKS3°2A(Lei，K?等人Molecularandcellularbiology22， 4929-4942 (2002) )，3)WTDLK相對JNK抑制劑情況下的WTDLK，和4)WTDLK相對大田軟海 綿酸情況下的WTDLK(圖5a)。
[0210] 鑒定了DLK上的一系列磷酸化肽，其豐度響應測試的條件而改變。在修正條件中 的整體DLK豐度的差異（參見材料和方法），鑒定磷酸化狀態與DLK和JNK-依賴性的磷 酸化一致的方式改變的位點（圖5b，c)。就改變幅度而言前三名的位點是N-末端結構域 的T43、激酶結構域中的S272、和緊接亮氨酸拉鏈結構域C-末端的S533。根據預測的JNK 和DLK活性，還對含有多個磷酸化位點的肽觀察到改變。發現激酶激活環（S295-T306)內 已知的磷酸化位點依賴于DLK的激酶活性，但不依賴于JNK。該研究結果與JNK不直接調節 DLK活性，而是控制影響DLK穩定性的因子的模型相匹配。有趣的是，在DLK的序列內，鑒定 出的第一名的位點含有與MAPK底物基序一致的側翼脯氨酸（Songyang，Z.等人Molecular and cellular biology16,6486-6493(1996))〇
[0211] 實施例6-鑒定的位點在穩定的DLK中是磷酸化的
[0212] 為了確定鑒定的前三名位點中的每個的磷酸化對DLK穩定性的影響，在293T細胞 中表達各自的丙氨酸點突變體。通過c-Jun磷酸化測量時對于DLK活性需要S272。不可能 將由S272突變體導致的DLK穩定性的改變與由于激酶活性缺失發生的那些相區分，因此不 進一步研究該點突變。有趣的是，對于DLK活性不需要T43和S533,但是DLKT431PDLKS533A 突變體以比野生型DLK更低的水平表達（圖6a)，與蛋白穩定性的降低一致。針對T43、S272 和S533殘基產生的磷酸化特異的抗體表明，不僅在點突變體中存在這些位點的磷酸化的 喪失，而且在激酶失活DLKS3°2A中也有，與質譜法結果一致（圖6a)。
[0213] 檢測在神經元中T43和S533的磷酸化是否以應激依賴性的方式發生。為了回答這 個問題，將野生型DRGs營養因子除去并且將裂解產物用特異于兩個磷酸化位點中的每個 的抗體印跡（圖6b)。靶向磷酸化-T43的抗體在-NGF條件下顯示免疫反應性，其通過入 磷酸酶處理消除，表明抗體對于磷酸化的靶抗原的特異性。印跡除去營養因子的DLKloxp/ loxpCre-和Cre+裂解產物，表明該抗體對DLK的特異性（圖6c)。此外，T43和S533二 者的磷酸化可以在從擠壓的視網膜免疫沉淀的DLK中檢測到（圖6d)。因此，T43和S533 在體內神經元應激后是磷酸化的，與這些位點的磷酸化促進神經元中DLK穩定性的假設一 致。使用純化的JNK和DLK的體外激酶測定表明，T43和S533二者都可以直接被JNK磷酸 化（圖6e)。因此，JNK可以直接在體內磷酸化DLK。
[0214] 實施例7-DLK以劑量依賴的方式調節下游促凋亡信號傳導
[0215] DLK蛋白量響應營養因子去除和視神經擠壓而增加的觀察結果提示檢測DLK蛋白 水平是否直接影響神經元應激后由DLK誘導的下游信號傳導的程度。為了這樣做，我們使 用大致表達WT同窩動物中存在的DLK量的50%的DLK敲除雜合子。在NGF去除的三小時時 間過程中（圖7a)，與WT對照相比，對于DLKK0等位基因雜合的神經元顯示更低的p-cjun 和p-JNK水平。因此，在DRGs中，DLK的量直接控制促凋亡信號傳導的量。
[0216] 在視網膜神經擠壓中，與DLK野生型小鼠相比，在DLK雜合小鼠中，存在類似的促 凋亡信號傳導的降低。在視神經擠壓后6小時，與在WT視網膜中發現的數量相比，雜合的 擠壓的視網膜中的P-cjun-陽性細胞核數量降低約70% (圖7b，c)。同樣，在擠壓后三天， DLK雜合子中胱天蛋白酶-3-陽性細胞的量降低> 85% (圖7d，e)，同時Brn3-陽性細胞核 的總數量增加> 2-倍（圖7d，f)。這些標志物的改變表明，存在消除的應激響應（Watkins， T.A.等人.出版中（2013))。在更晚的時間點，這些標志物變得不能與在WT視網膜中觀 察到的相區分，表明雜合子中降低的凋亡信號傳導是推遲，而不是絕對的降低（圖11)。這 不同于DLK敲除，其中促凋亡信號傳導在神經擠壓后被阻斷（Watkins，T.A.等人.出版中 (2013))。因此，在神經元應激后，DLK水平的調節調整體內和體外下游凋亡信號傳導的量 和進程。
[0217] 建議的是，DLK水平在正常條件下通過Phrl和USP9X緊密調節。尤其在Phrl突變 體中，在缺少應激的情況下，DLK水平增加，但這不導致下游信號傳導；因此，需要另外的因 素用于DLK激活。神經元應激（例如除去NGF和損傷）導致DLK激酶活性的激活和下游靶 點MKK4/7和JNK的磷酸化。然后JNK-依賴性的反饋機制導致DLK的磷酸化和穩定化。如 在NGF去除中觀察到的，穩定化通過泛素化的改變而發生。泛素化的該改變可能通過Phrl活性或DLK對Phrl的底物利用度的改變而發生，盡管可能另外的E3泛素連接酶也參與DLK 的泛素化。在任何情況下，由于來自JNK的正反饋引起的泛素化的降低導致DLK水平快速 的、開關樣的（switch-like)的上調和凋亡和軸突變性的激活。
[0218] DLK激酶活性需要同源二聚化和自磷酸化（Nihalani，D.，Merritt，S. &Holzman， L.B. (2000))，并且激活環上的自磷酸化是相關激酶MLK3的激酶活性所需的（Leung， I.W. &Lassam，N. (2001))。因此，假設在NGF去除和神經擠壓中所觀察到的DLK的磷酸化 是DLK激活環上自磷酸化，或通過上游激活激酶導致的DLK激活環的磷酸化的結果，將是合 理的。這的確可能解釋JNK抑制不完全抑制神經元應激后DLK內所有位點的磷酸化的觀察 結果（圖4)。激酶調節機制的理解主要集中在許多激酶的激活環的磷酸化上。上述實驗提 供其中激活環外的特定殘基的DLK磷酸化需要下游激酶的不同機制的證據。這些殘基的磷 酸化影響DLK的穩定性但不影響DLK活性。
[0219] 氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺
[0220] 盡管為了清楚理解，之前的發明已經通過說明和實例的方式詳細描述，說明書和 實施例不應該被認為限制本發明的范圍。本文引用的所有專利和科學文獻的公開內容明確 通過引用以其整體并入。
【主權項】
1. 一種降低神經元中雙亮氨酸拉鏈激酶（DLK)穩定性的方法，所述方法包括向神經 元、或其部分施用降低或抑制DLK的磷酸化和降低DLK穩定性的試劑。2. -種降低或抑制雙亮氨酸拉鏈激酶（DLK)的某些氨基酸殘基的磷酸化的方法，所述 方法包括向神經元或其部分施用降低或抑制DLK的磷酸化的試劑，其中磷酸化的降低或抑 制導致DLK蛋白穩定性的降低。3. -種抑制或預防患者中神經元變性的方法，其中所述方法包括向患者施用降低或抑 制雙亮氨酸拉鏈激酶（DLK)的磷酸化的試劑，其中磷酸化的降低或抑制降低DLK的穩定性。4. 權利要求1-3任一項所述的方法，其中所述試劑降低或抑制特定DLK氨基酸殘基的 磷酸化。5. 權利要求4所述的方法，其中所述特定DLK氨基酸殘基選自：SEQ ID NO :1 (人）第 43位的蘇氨酸（T43) ;SEQ ID NO :2 (小鼠）第43位的蘇氨酸；SEQ ID NO :1 (人）第500 位的絲氨酸（S500) ;SEQ ID N0:2(小鼠）第533位的絲氨酸（S533);和來自其它物種或同 種型的DLK中的等同殘基。6. 權利要求1-5中任一項所述的方法，其中降低或抑制DLK磷酸化的試劑選自抗體、小 分子、多肽和短干擾RNA(SiRNA)。7. 權利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述試劑是抗體。8. 權利要求7所述的方法，其中所述抗體選自多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人 源化抗體、Fv片段、Fab片段、Fab'片段和F(ab'） 2片段。9. 權利要求1-8中任一項所述的方法，其中所述神經元或其部分存在于人受試者中， 存在于神經移植物或神經移植體中，或是離體的或體外的。10. 權利要求1-9中任一項所述的方法，其中所述神經元選自由以下組成的組：小腦顆 粒神經元、背根神經節神經元、視網膜神經節細胞神經元和皮質神經元。11. 權利要求1-10中任一項所述的方法，其中DLK磷酸化的降低或抑制不影響DLK激 酶活性。12. 權利要求1-11中任一項所述的方法，其中所述試劑是JNK的抑制劑。13. 權利要求1-12中任一項所述的方法，其中所述方法還包括施用JNK的抑制劑。14. 權利要求12或13所述的方法，其中JNK的抑制劑抑制選自JNKl ;JNK2 ;JNK3 ;以 及JNK1、JNK2和JNK3的任意組合的JNK。15. 權利要求14所述的方法，其中JNK的抑制劑選自JNK抑制劑V、JNK抑制劑 VII (TAT-TI-JIP153 163)、JNK 抑制劑 VIII 和 siRNA。16. 權利要求3-15中任一項所述的方法，其中所述患者患有選自下述的疾病或病癥： 阿爾茨海默病、帕金森病、帕金森疊加病、肌萎縮性側索硬化（ALS)、三叉神經痛、舌咽神經 痛、貝爾麻痹、重癥肌無力、肌營養不良、進行性肌萎縮、原發性側索硬化（PLS)、假延髓性麻 痹、進行性延髓性麻痹、脊髓性肌萎縮、遺傳性肌萎縮、無脊椎動物盤綜合征、頸椎病、神經 叢疾病、胸廓出口破壞綜合征、周圍神經病、撲啉病、亨廷頓病、多系統萎縮、進行性核上性 麻痹、皮質基底節變性、路易小體癡呆、額顳葉癡呆、脫髓鞘性疾病、吉蘭-巴雷綜合征、多 發性硬化、進行性神經性腓骨肌萎縮癥、朊病毒病、克羅伊茨費爾特-雅各布病、格-施-沙 綜合征（GSS)、致死性家族失眠癥（FFI)、牛海綿狀腦病、皮克病、癲癇、和AIDS癡呆綜合征、 慢性疼痛、纖維肌痛、脊柱痛、腕管綜合征、來自癌癥的疼痛、關節炎、坐骨神經痛、頭痛、外 科手術疼痛、肌肉痙攣、背痛、內臟痛、受傷疼痛、牙痛、神經痛比如神經原性或神經病性疼 痛、神經炎癥或損傷、帶狀皰疹、椎間盤突出、韌帶撕裂、和糖尿病、由糖尿病、癌癥、AIDS、肝 炎、腎功能障礙、科洛拉多蜱傳熱、白喉、HIV感染、麻風、萊姆病、結節性多動脈炎、類風濕性 關節炎、結節病、舍格倫綜合征、梅毒、系統性紅斑狼瘡、或淀粉樣變性引起的周圍神經病或 神經痛、暴露于毒性化合物、重金屬、工業溶劑、藥物、化療劑、氨苯砜、HIV藥物、降膽固醇藥 物、心臟或血壓藥物、或甲硝唑而引起的神經損傷、由物理、機械或化學外傷引起的神經系 統損傷、神經分裂癥、妄想性精神障礙、分裂情感性精神障礙、精神分裂癥樣、分擔類精神障 礙、精神病、偏執性人格障礙、分裂樣人格障礙、邊緣型人格障礙、反社會性人格障礙、自戀 性人格障礙、強迫性障礙、譫妄、癡呆、心境障礙、雙相性精神障礙、抑郁癥、應激障礙、驚恐 性障礙、廣場恐怖癥、社交恐怖癥、外傷后應激障礙、焦慮癥、和沖動控制障礙、青光眼、角膜 網絡狀營養不良、色素性視網膜炎、年齡相關的黃斑變性（AMD)、與濕性或干性AMD相關的 光受體變性、其它視網膜變性、視神經玻璃疣、視神經病、和視神經炎。17. 檢測神經元中應激依賴性或促凋亡DLK活性的方法，所述方法包括：(a)將生物樣 品與特異識別DLK的磷酸化形式的抗體接觸；和（b)檢測抗體對生物樣品內DLK磷酸化形 式的結合，其中被抗體結合表明應激依賴性或促凋亡DLK活性。18. 權利要求17所述的方法，所述方法還包括測量抗體對DLK的磷酸化形式的結合，其 中相對于對照，生物樣品中抗體結合的增加表明應激依賴性或促凋亡DLK活性。19. 權利要求17或18所述的方法，其中所述生物樣品包含選自神經元、神經元細胞裂 解產物和從神經元純化的DLK的生物材料。20. 權利要求17-19中任一項所述的方法，其中所述抗體特異性結合在選自下述的氨 基酸殘基處磷酸化的DLK:SEQ ID NO:l(人）第43位的蘇氨酸（T43) ;SEQ ID NO:2(小鼠） 第43位的蘇氨酸；SEQ ID NO : 1 (人）第500位的絲氨酸（S500) ;SEQ ID NO :2 (小鼠）第 533位的絲氨酸（S533);和來自其它物種或同種型的DLK中的等同殘基。21. 權利要求1-16中任一項所述的方法，其中DLK的磷酸化是對神經元應激或損傷的 響應。
【專利摘要】本發明提供降低神經元中雙亮氨酸拉鏈激酶(DLK)穩定性，或降低或抑制DLK的某些氨基酸殘基的磷酸化的方法，所述方法包括向神經元、或其部分施用降低或抑制DLK的磷酸化和降低DLK的穩定性的試劑，以及用于抑制或預防患者中神經元變性的方法，所述方法通過向患者施用抑制雙亮氨酸拉鏈激酶(DLK)的磷酸化的試劑進行。
【IPC分類】A61K39/395, A61P25/28, A61K31/7105
【公開號】CN105050620
【申請號】CN201480011170
【發明人】黛西·布斯托斯, 薩拉·亨特沃克-羅德里格斯, 唐納德·柯克帕特里克, 約瑟夫·韋斯利·盧科克, 阿倫德哈蒂·森古普塔·戈什
【申請人】霍夫曼-拉羅奇有限公司
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2014年2月27日
【公告號】CA2900553A1, US20150361184, WO2014134349A1