調節dlk穩定性的方法
【專利說明】調節DLK穩定性的方法
[0001] 相關申請
[0002] 本申請要求2013年2月28日提交的美國臨時申請號61/770, 959的權益，其通過 引用以其整體并入本文。 發明領域
[0003] 本發明涉及通過抑制DLK磷酸化來降低雙亮氨酸拉鏈激酶（DLK)的穩定性從而預 防神經元變性的方法。
[0004] 背景
[0005] 軸突變性和神經元細胞死亡在改善神經元連接的發育過程中（Oppenheim， R.ff.Annualreviewofneuroscience14,453-501 (1991) ；Luo,L. & 0 'Leary, D.D.Annualreviewofneuroscience28，127_156(2005))，損傷后清除損傷細 胞(Quigley,H.A.等人Investigativeophthalmology&visualscience36， 774-786(1995))，和在神經變性疾病比如帕金森病、肌萎縮性側索硬化（ALS)和阿爾茨海 默病（Vila，M. &Przedborski，S.Naturereviews.Neuroscience4,365_375(2003)) 中發生。在這些背景下引發神經變性的因素廣泛變化的同時，對于很多神經變性背景 似乎常見的保守信號傳導事件已經被鑒定為起始軸突變性和神經元凋亡。其一個實 例是JunN-末端激酶（JNKs)，在兩種發育中，其在激活軸突變性和神經元凋亡中作 用于Bax和c-Jun的上游（Ham，J?等人Neuron14,927-939 (1995) ;Kuan，C.Y?等人 Neuron22,667-676(1999) ;Southwell，D.G?等人Nature491，109-113(2012);White， F.A. ,Keller-Peck,C.R. ,Knudson,C.M. ,Korsmeyer,S.J. &Snider,ff.D.TheJournal ofneuroscience：theofficialjournaloftheSocietyforNeuroscience18， 1428-1439(1998))，并且作為神經變性疾病的病理學的一部分（Hunot，S.等人PNAS101， 665-670(2004) ；Martin,L.J.Journalofneuropathologyandexperimentalneurology 58,459-471 (1999) ;Vila，M?等人PNAS98,2837-2842(2001) ;Yao,M.，Nguyen，T.V. & Pike,C.J.TheJournalofneuroscience：theofficialjournaloftheSocietyfor Neuroscience25,1149-1158(2005))。在這些背景下，Bax-依賴性胱天蛋白酶激活似乎 對于進行JNK激活下游的程序性細胞死亡和軸突變性是必要的（Simon，D.J.等人The Journalofneuroscience：theofficialjournaloftheSocietyforNeuroscience 32,17540-17553(2012) ；Pettmann,B. &Henderson,C.E.Neuron20,633-647(1998)； Gagliardini，V?等人Science263,826_828(1994) ;Yuan，J. &Yankner，B.A.Nature407， 802-809(2000))〇
[0006] 帶有雙亮氨酸拉鏈的激酶（DLK)是需要應激誘導的神經元JNK激活的混合譜 系（mixedlineage)激酶（MLK)家族的進化保守的、高度神經元特異的成員（Hirai， S?等人Geneexpressionpatterns:GEP5, 517-523 (2005) ;Ghosh，A.S?等人The Journalofcellbiology194,751_764(2011) ;Watkins，T.A?等人DLKinitiatesa transcriptionalprogramthatcouplesapoptoticandregenerativeresponses toaxonalinjury?出版中（2013) ;Chen，X?等人TheJournalofneuroscience：the officialjournaloftheSocietyforNeuroscience28,672-680(2008)。哺乳動物 中DLK的喪失足以減弱發育中的凋亡和軸突變性以及接著的軸突損傷（Ghosh，A.S.等 人（2011) ;Watkins，T.A?等人.出版中（2013) ;Chen，X?等人（2008) ;Miller，B.R?等 人Natureneuroscience12, 387-389 (2009))。在無脊椎動物中，通過連續遺傳篩選鑒定 了DLK的明顯的功能，其表明E3泛素連接酶的PHR家族（PAM/highwire/RPM-1)負性調節 DLK水平以控制突觸發育（Collins，C.A.，Wairkar，Y.P.，Johnson，S.L. &DiAntonio， A.Neuron51,57-69(2006) ;Nakata，K?等人Cell120,407-420(2005))。去泛素化酶 (DUB)fatfacets(faf)的過表達產生類似于highwire突變體的突觸表型，提示Faf可能 對抗PHR連接酶以正性調節DLK水平（Collins，C.A.，Wairkar，Y.P.，Johnson，S.L. & DiAntonio，A. (2006))。類似的機制似乎在果繩（Drosophila)中神經損傷之后調節DLK，其 中DLK水平以PHR-依賴性方式快速上調（Xiong，X.等人TheJournalofcellbiology 191,211-223(2010))。在線蟲（C.elegans)中，損傷后DLK活性也通過與將DLK激活限制 于神經元的損傷區域的更短的DLK同種型異二聚化來調節（Yan，D. &Jin，Y.Neuron76， 534-548(2012))。
[0007] 盡管通過無脊椎系統中的研究獲得了機制知識，關于在哺乳動物神經元中DLK是 否被類似調節，知道的很少。缺乏Phrl(小鼠PHR泛素連接酶）表達的小鼠在整個腦中在 DLK豐度方面未顯示明顯的改變，并且DLK的喪失未能抑制在Phrl突變體中觀察到的軸突 路徑尋找缺陷（Bloom，A.J.，Miller，B.R.，Sanes，J.R. &DiAntonio,A.Genes&發育 21， 2593-2606(2007))。然而，在神經元損傷的范例中通過泛素-蛋白酶體系統對DLK水平的 調節尚未嚴格檢查。
[0008] DLK是感受神經元損傷并引發變性和再生信號傳導的MAP3K(Ghosh，A.S.等人 (2011) ;Watkins，T.A?等人.出版中（2013) ;Miller，B.R?等人（2009) ;Shin，J.E?等人 神經元74,1015-1022 (2012))。DLK的喪失足以以多種神經元應激范例完全抑制JNK激活 和下游響應（Watkins，T.A.等人.出版中（2013)，但在哺乳動物神經元中DLK自身如何被 神經元應激調節尚不清楚。本文中描述的實施例表明，在哺乳動物神經元中：（1)響應神經 元應激，DLK量早期快速增加，（2)，DLK水平受正反饋環控制，其中JNK活性調節許多DLK內 調節蛋白穩定性的位點的磷酸化（3)DLK水平受Phrl和USP9X調節，（4)DLK蛋白穩定性的 改變可以獨立于應激誘導的DLK信號傳導激活而發生，和（5)DLK蛋白量直接控制下游信號 傳導量。
[0009] 概述
[0010] 本發明提供通過抑制雙亮氨酸拉鏈激酶（DLK)的磷酸化調節DLK穩定性的方法。 本發明還提供通過施用抑制DLK的磷酸化，尤其是，抑制DLK的特定氨基酸殘基的磷酸化的 試劑抑制或預防患者中神經元變性的方法。
[0011] 本發明基于這樣的觀察結果：各種類型的神經元應激后DLK水平可再現地增加。 不受理論限制，盡管，Phrl和去泛素化酶（DUB)USP9X都不調節DLK活性，但行使功能以緊 密調節神經元中DLK蛋白的豐度。神經元-損傷-依賴性激活后，DLK成為高度磷酸化的， 其通過不同于調節DLK激酶活性的那些的激酶結構域外的特異JNK依賴性磷酸化事件導致 增加的蛋白穩定性。因此，DLK通路激活產生增加DLK蛋白水平的反饋機制，其轉而增強下 游靶點的磷酸化并將分級的或局部DLK信號傳導轉化為允許神經元正確針對損傷進行反 應的更完全的響應。
[0012] 在一個實施方案中，本發明提供降低神經元中雙亮氨酸拉鏈激酶（DLK)穩定性的 方法，所述方法包括向神經元、或其部分，施用、降低或抑制DLK的磷酸化和降低DLK穩定性 的試劑。在某些實施方案中，所述試劑抑制或降低特定的一個DLK氨基酸殘基或多個DLK 氨基酸殘基的磷酸化。
[0013] 在其它實施方案中，本發明提供抑制或降低雙亮氨酸拉鏈激酶（DLK)的某些氨基 酸殘基的磷酸化的方法，所述方法包括向神經元或其部分施用抑制或降低DLK的某些氨基 酸殘基的磷酸化的試劑，其中磷酸化的抑制或降低導致DLK蛋白穩定性的降低。
[0014] 在其它實施方案中，本發明提供抑制或預防患者中神經元變性的方法，其中所述 方法包含向患者施用抑制或降低雙亮氨酸拉鏈激酶（DLK)的磷酸化的試劑，其中磷酸化的 抑制或降低降低DLK的穩定性。在某些實施方案中，所述試劑抑制或降低特定的一個DLK 氨基酸殘基或多個DLK氨基酸殘基的磷酸化。
[0015] 在其它實施方案中，本發明提供檢測神經元中應激依賴性或促凋亡DLK活性的方 法，所述方法包括：(a)將生物樣品與特異識別DLK的磷酸化形式的抗體接觸；和（b)檢測 抗體對生物樣品內DLK的磷酸化形式的結合，其中被抗體結合表明應激依賴性或促凋亡 DLK活性。在某些實施方案中，所述方法還包含測量抗體對DLK的磷酸化形式的結合，其中 相對于對照，在生物樣品中對抗體結合的增加，表明神經元中應激依賴性或促凋亡DLK活 性。在其它實施方案中，生物樣品包含選自神經元、神經元細胞裂解產物和從神經元純化的 DLK的生物材料。
[0016] 在某些實施方案中，用于本發明的方法的試劑抑制或降低特定DLK氨基酸殘基的 磷酸化，比如SEQIDN0 :1 (人DLK)第43位的蘇氨酸（T43);SEQIDN0 :2 (鼠DLK)第43 位的蘇氨酸；SEQIDN0 :1 (人DLK)第500位的絲氨酸（S500);SEQIDN0 :2 (鼠DLK)第 533位的絲氨酸（S533)或其任意組合。在另外的實施方案中，用于本發明方法的試劑抑制 特定氨基酸殘基的磷酸化，所述特定氨基酸殘基為來自其它物種或同種型的DLK中與SEQ IDN0 :1(人DLK)第43位的蘇氨酸（T43);SEQIDN0 :2(鼠DLK)第43位的蘇氨酸；SEQID NO: 1 (人DLK)第500位的絲氨酸（S500);SEQIDNO:2 (鼠DLK)第533位的絲氨酸（S533) 等同的殘基和其任意組合。
[0017] 在其它實施方案中，本發明方法的試劑選自抗體、小分子、多肽和短干擾 RNA(siRNA)。在某些實施方案中，所述試劑是抗體。在特定實施方案中，所屬抗體選自多克 隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、Fv片段、Fab片段、Fab'片段和F(ab'）2片段。
[0018] 在進一步實施方案中，將用于本發明方法的試劑施用于神經元或其部分。在某些 實施方案中，所述神經元或其部分存在于人受試者中、神經移植物或神經移植體中，或是離 體的（exvivo)或體外的（invttro)。
[0019] 在另外的實施方案中，用于本發明方法的試劑是JNK抑制劑和/或所屬方法還包 括施用其它試劑，所述試劑是JNK抑制劑。在特定實施方案中，所述JNK抑制劑抑制JNK1、 JNK2、JNK3或JNK1，JNK2和JNK3的任意組合。在某些實施方案中，用于本發明方法的JNK 抑制齊丨J抑制JNK1、JNK2和JNK3 ;或JNK1和JNK2 ;或JNK1和JNK3 ;或JNK2和JNK3〇在特 定實施方案中，所述JNK抑制劑選自JNK抑制劑V、JNK抑制劑VII(TAT-TI-JIP153163)、JNK 抑制劑VIII和siRNA，其抑制JNK多肽的表達。
[0020] 在另外的實施方案中，治療的患者患有選自以下各項的疾病或病癥：阿爾茨海默 病、帕金森病、帕金森疊加病（Parkinson' s-plus diseases)、肌萎縮性側索硬化（ALS)、 三叉神經痛（trigeminal neuralgia)、舌咽神經痛（glossopharyngeal neuralgia)、 貝爾麻痹（Bell' s Palsy)、重癥肌無力（myasthenia gravis)、肌營養不良（muscular dystrophy)、進行性肌萎縮（progressive muscular atrophy)、原發性側索硬化（primary lateral sclerosis，PLS)、假性延髓性麻痹（pseudobulbar palsy)、進行性延髓性麻痹 (progressive bulbar palsy)、脊髓性肌萎縮（spinal muscular atrophy)、遺傳性肌萎縮 (inherited muscular atrophy)、無脊椎動物盤綜合征（invertebrate disk syndromes)、 頸椎病（cervical spondylosis)、神經叢疾病（plexus disorders)、胸廓出口破壞綜合征 (thoracic outlet destruction syndromes)、周圍神經病（peripheral neuropathies)、口卜 口林病（prophyria)、亨廷頓病、多系統萎縮（multiple system atrophy)、進行性核上性麻痹 (progressive supranuclear palsy)、皮質基底節變性（corticobasal degeneration)、路 易小體癡呆（dementia with Lewy bodies)、額顳葉癡呆（frontotemporal dementia)、脫 髓鞘性疾病（demyelinating diseases)、吉蘭-巴雷綜合征（Guillain_Barr6syndrome)、 多發性硬化（multiple sclerosis)、進行性神經性腓骨肌萎縮癥（Charcot-Marie-Tooth disease)、朊病毒病（prion disease)、克羅伊茨費爾特-雅各布病（Creutzfeldt-Jakob disease)、格-施-沙綜合征（Gerstmaim-Btltussier-Schdnkersyndrome) (GSS)、致 死性家族失眠癥（fatal familial insomnia，FFI)、牛海綿狀腦病（bovine spongiform encephalopathy)、皮克病（Pick' s disease)、癲癇（epilepsy)、和AIDS癡呆綜合征、慢 性疼痛、纖維肌痛（fibromyalgia)、脊柱痛、腕管綜合征（carpel tunnel syndrome)、癌癥 痛、關節炎、坐骨神經痛、頭痛、外科手術疼痛、肌肉痙攣、背痛、內臟痛、損傷疼痛、牙痛、神 經痛、比如神經原性或神經病性疼痛、神經炎癥或損傷、帶狀皰疹、椎間盤突出（herniated disc)、韌帶撕裂（torn ligament)、和糖尿病、由糖尿病、癌癥、AIDS、肝炎、腎功能障礙、科 洛拉多蜱傳熱（Colorado tick fever)、白喉（diphtheria)、HIV感染、麻風（leprosy)、 萊姆病（lyme disease)、結節性多動脈炎（polyarteritis nodosa)、類風濕性關節炎、結 節病（sarcoidosis)、舍格倫綜合征（Sjogren syndrome)、梅毒（syphilis)、系統性紅斑 狼瘡（systemic lupus erythematosus)、或淀粉樣變性（amyloidosis)引起的周圍神經 病或神經痛、由暴露于毒性化合物、重金屬、工業溶劑、藥物、化療劑、氨苯諷（dapsone)、 HIV藥物、降膽固醇藥物、心臟或血壓藥物、或甲硝挫（metronidazole)引起的神經損傷、 由物理、機械或化學外傷引起的神經系統損傷、神經分裂癥（schizophrenia)、妄想性精 神障礙（delusional disorder)、分裂情感性精神障礙（schizoaffective disorder)、 精神分裂癥樣（schizopheniform)、分擔類精神障礙（shared psychotic disorder)、精 神病（psychosis)、偏執性人格障礙（paranoid personality disorder)、分裂樣人格 障礙（schizoid personality disorder)、邊緣型人格障礙（borderline personality disorder)、反社會性人格障礙（anti-social personality disorder)、自戀性人格 障石導(narcissistic personality disorder)、強迫性障石導(obsessive-compulsive disorder)、譫妄（delirium)、癡呆（dementia)、心境障礙（mood disorders)、雙相性精 神障礙（bipolar disorder)、抑郁癥、應激障礙（stress disorder)、驚恐性障礙（panic disorder)、廣場恐怖癥（agoraphobia)、社交恐怖癥（socialphobia)、外傷后應激障 礙（post-traumaticstressdisorder)、焦慮癥（anxietydisorder)、和沖動控制障礙 (impulsecontroldisorders)、青光眼、角膜網絡狀營養不良（latticedystrophy)、色素 性視網膜炎（retinitispigmentosa)、年齡相關的黃斑變性（AMD)、與濕性或干性AMD相關 的光受體變性、其它視網膜變性、光神經玻璃疣、視神經病、和視神經炎。
[0021] 附圖簡述
[0022] 圖1體外和體內應激范例中，DLK蛋白水平和分子量響應神經元應激增加。（a)在 神經生長因子（NGF)的存在下將胚胎背根神經節（DRG)神經元培養5天并且隨后在四個分 開的試驗中除去NGF3小時。作為響應，DLK量增加并且該增加伴隨著DLK迀移率向上迀 移。cjun磷酸化（p-cjun)作為DLK激活的下游結果發生。（b)手術后3天收集視神經被 擠壓的視網膜和其未被擠壓的對側對照。在視網膜神經擠壓后，擠壓的視網膜中DLK水平 和分子量增加3天。（c)視網膜神經擠壓模型的示意圖，顯示視網膜的位置、擠壓位點、近 端神經和遠端神經。（d)在擠壓的神經內，僅近端神經中的DLK在神經擠壓后經歷整個視 網膜中觀察到的分子量和量的應激依賴性的增加。神經擠壓在給定基因型的小鼠上進行并 且在 24 小時后收集神經。WT:C57BL/6.Cre-ALK^/DLI^'Cre-.Cre+:DLK 在擠壓（紅色箭頭）后在近端神經中可以觀察到迀移率的迀移。*:對DLK印跡的神經裂 解產物中觀察到的背景條帶。（e)(a)中顯示的-NGF相對+NGF樣品的和（b)中顯示的擠 壓的相對未擠壓的樣品的DLK蛋白量的平均比例。在各個應激范例中，在ImageLab中測 量DLK的量并且標準化為肌動蛋白上樣對照。在NGF去除樣品中，對于條件的各個相鄰組 采集-NGF和+NGF的DLK比例。在視網膜神經擠壓中，對于四只小鼠中的每一只，采集擠壓 的和未擠壓的眼中DLK量的比例。TF去除：平均值=2. 12±0. 127。神經擠壓：平均值= 1.497±0. 157。*通過Mann-WhitneyU檢驗，將平均值與 1 相比，P= 0.02。（f)+NGF和-NGF 樣品中DLK的平均分子量（MW)。在ImageLab中使用分子量分析工具，將DLK的分子量與 已知的一組分子量標準進行比較來計算分子量。+NGF:平均值=115. 1±. 7723。-NGF:平 均值=12〇.〇±.8〇5〇。通過Mann-WhitneyU檢驗，*P= 0.〇3。（g)A蛋白磷酸酶（App) 處理DRG裂解產物使-NGF和+NGF條件下的DLK分子量相等。所有誤差線是平均值的標準 誤差。
[0023] 圖2在胚胎感覺神經元中，響應于營養因子去除，DLK蛋白被穩定。（a)在-NGF相 對+NGF培養條件（藍色線條）中或在來自3個重復小鼠的擠壓的相對未擠壓的視網膜（黑 色線條）中通過qRT-PCR測量DLK轉錄本的相對量。誤差線是基于三個技術重復的標準偏 差。-NGF相對+NGF:L036±0. 0234。小鼠 1 :0? 995±. 0315。小鼠 2 :0? 970±. 0462。小鼠 3 :0989±0. 040。（b)在5yM放線菌酮的存在下營養因子去除和+NGF對照的8-小時時間 進程。（c) (b)中進行的實驗的三個重復試驗的定量。相對于肌動蛋白上樣對照對各個時間 點的條帶進行定量，并且計算各個時間點的平均條帶強度并除以t= 0時的強度。繪制的是 與在時間〇的量相比在給定時間殘留的DLK的相對量。誤差線是標準偏差。每個時間過程 匹配于GraphPadPrism軟件中的線。當用ANC0VA比較兩條線的斜率時，*P= 0.0109。（d) 將DRGs用給定條件處理三小時并裂解。0A:200nM大田軟海綿酸（okadaicacid)。MG132 以30yM使用。
[0024] 圖3泛素-蛋白酶體系統以應激依賴性的方式調節DLK水平。（a)通過營養因子 去除來減少DLK泛素化。收集除去NGF的和對照DRGs并在3小時的處理后裂解。將泛素 化的蛋白從裂解產物免疫沉淀并且將免疫沉淀對DLK和泛素印跡。使用小鼠IgG對照作 為陰性對照以證明抗體特異性。（b)在NGF去除后在USP9Xloxp/loxpCre-和Cre+胚胎 DRGs中對DLK、USP9X、p-cjun和微管蛋白的蛋白質印跡。（c)對于DLK和USP9X的印跡的 定量顯示在（b)中。USP9X(左圖）的~95%的喪失導致DLK水平的總體降低，但是不改變 +和-NGF條件中DLK的相對水平（右圖：Cre+相對于Cre-的倍數改變）。（d)與PhrlWT 相比，在Phrlma7A能喪失的突變體中，+NGF條件中DLK蛋白水平升高。盡管有該增加，在 Phrimag突變體中p-cjun的下游激活未受影響。（e)對Tuj上樣對照標準化的（d)中顯示的 DLK印跡的定量。（f)泛素化蛋白的免疫沉淀表明，DLK在Phrlmag/mag純合子中比在PhrWT/