roc.Natl.Acad.Sci.USA77 : 4216(1980));和骨髓瘤細胞系比如Y0、NS0和Sp2/0。對于適于抗體制備的某些哺乳動物 宿主細胞系的綜述，參見，例如，Yazaki和Wu，MethodsinMolecularBiology，Vol.248(B. K.C.Lo,編輯，HumanaPress，Totowa，NJ)，pp. 255-268 (2003)。
[0156] C.用于診斷和檢測的方法和組合物
[0157] 在某些實施方案中，在本文中提供的任何試劑用于檢測生物樣品中磷酸化的DLK 或DLK的特定磷酸化形式。如本文使用的術語"檢測"包括定量或定性檢測。在某些實施 方案中，生物樣品包括細胞或組織，比如神經元或其部分。
[0158] 在一個實施方案中，提供用于診斷或檢測的方法的試劑。在進一步的方面，提供 檢測生物樣品中磷酸化的DLK和/或DLK的特定磷酸化形式（例如，在選自人或鼠DLK序 列（分別為SEQIDNOs:1和2)第43位的蘇氨酸的氨基酸殘基處；在人DLK序列（SEQID NO:1)第500位的絲氨酸處和鼠DLK序列（SEQIDNO:2)第533位的絲氨酸處磷酸化的 DLK;和其任意組合）的存在的方法。在某些實施方案中，所述方法包括將生物樣品與特異 識別本文所述的DLK磷酸化形式的抗體，在允許抗體結合DLK的磷酸化形式的條件下相接 觸，并且檢測在抗體和DLK的磷酸化形式之間是否形成復合體。這種方法可以是體外或體 內方法。所述抗體用于選擇具有應激依賴性和/或促凋亡DLK活性的神經元和/或檢測應 激依賴性的和/或促凋亡DLK活性。
[0159] 在某些實施方案中，提供用于本發明方法的標記的抗體。標記包括，但不限于，直 接檢測的標記或部分（比如熒光、發色團、電子致密、化學發光和放射活性標記），以及例 如，通過酶反應或分子相互作用直接檢測的部分，比如酶或配體。示例性的標記包括，但不 限于，放射性同位素 32P、14C、125I、3H和1311、熒光團比如稀土螯合物或熒光素和其衍生物、丹 磺酰、傘形酮、熒光素酶，例如，螢火蟲熒光素酶和細菌熒光素酶（美國專利號4, 737, 456)、 熒光素、2, 3-二氫酞嗪二酮、辣根過氧化物酶（HR)、堿性磷酸酶，0 -半乳糖苷酶、葡糖淀 粉酶、溶菌酶、糖氧化酶例如，葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸鹽脫氫酶，雜 環氧化酶比如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶，其與使用過氧化氫以氧化染料前體比如HRP的酶偶 聯，乳過氧化物酶，或微過氧化物酶，生物素/親和素，自旋標記，細菌噬菌體標記，穩定自 由基，等。
[0160] D?治療方法和組合物
[0161] 本文中提供的任何試劑可以用于治療方法。
[0162] 在某些實施方案中，本發明提供一種試劑，所述試劑用于治療具有神經變性疾病、 病狀或病癥的個體的方法，所述方法包括向個體施用有效量的試劑。在一個這種實施方案 中，所述方法還包括向個體施用有效量的至少一種其它治療劑，例如，下文所述的。在進一 步實施方案中，本發明提供一種試劑，所述試劑用于抑制或預防神經元變性。在某些實施方 案中，本發明提供一種試劑，所述試劑用于抑制或預防個體中神經元變性的方法，所述方法 包括向個體施用有效量的試劑以抑制或降低DLK的磷酸化并且從而降低DLK蛋白穩定性。 根據任意上述實施方案，"個體"優選是人。
[0163] 用于本發明方法的試劑（和任何其它治療劑）可以通過任何合適的方式施用，包 括腸胃外、肺內、和鼻內，并且如果需要用于局部治療，在病灶內施用。腸胃外輸注包括肌肉 內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下施用。劑量給藥可以通過任何合適的途徑進行，例如通過 注射，比如部分根據施用是否短暫或長久，靜脈內或皮下注射。各種劑量給藥時間安排包括 但不限于經各個時間點的單次或多次施用，推注施用，并且在本文中考慮脈沖輸注。
[0164] 與優良臨床實踐一致的方式配制、劑量給藥和施用用于本發明方法的試劑。在該 情況下考慮的因素包括要治療的特定疾病、治療的特定哺乳動物、個體患者的臨床狀況、病 癥的原因、遞送試劑的位點、施用方法、施用時間安排、和執業醫生已知的其它因素。抗體不 需要，但任選地與一種以上目前用于預防或治療所述疾病的試劑一起配制。這種其它試劑 的有效量依賴于存在于制劑中的抗體的量、疾病或治療的類型、和上文討論的其它因素。這 些通常以相同劑量和以本文所述的施用途徑施用，或以約本文所述的劑量的約1至99%， 或以經驗上/臨床上確定為合適的任何劑量和任何途徑使用。
[0165] 當試劑靶點位于腦中時，本發明的某些實施方案提供試劑以穿過血腦屏障。某些 神經變性疾病與血腦屏障的滲透性的增加相關，從而試劑（例如，抗體或抗原-結合片段） 被容易地引入腦。當血腦屏障保持完整時，存在一些本領域已知的方式，用于將分子跨過其 轉運，包括，但不限于，物理方法、基于脂的方法、和基于受體和通道的方法。
[0166] 將試劑比如抗體或抗原-結合片段跨血腦屏障轉運的物理方法包括，但不限于， 完全繞開血腦屏障，或通過在血腦屏障上產生開口。繞開方法包括，但不限于，直接注射入 腦（參見，例如，Papanastassiou等人，GeneTherapy9 :398_406,2002)，間隙輸注 / 增強 傳送的遞送（參見，例如，Bobo等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 91 :2076-2080,1994)， 和在腦中移植遞送裝置（參見，例如，Gill等人，NatureMed. 9 :589-595,2003 ;和Gliadel Wafers.TM.，GuildfordPharmaceutical)。在屏障中產生開口的方法包括，但不限于， 超聲（參見，例如，美國專利公開號2002/0038086)，滲透壓（例如，通過施用高滲甘露醇 (Neuwelt，E.A.，ImplicationoftheBlood-BrainBarrieranditsManipulation，第 1 和2卷，PlenumPress，N.Y.，1989))，由例如，緩激肽（bradykinin)或透化劑A_7透化（參 見，例如，美國專利號5, 112, 596、5, 268, 164、5, 506, 206和5, 686, 416)，以及用含有編碼抗 體或抗原-結合片段的基因的載體轉染跨在血腦屏障上的神經元（參見，例如，美國專利公 開號 2003/0083299)。
[0167] 將試劑比如抗體或抗原-結合片段跨血腦屏障轉運的基于脂的方法包括，但不 限于，將抗體或抗原-結合片段包裹在脂質體中，所述脂質體與結合血腦屏障的血管內皮 細胞上的受體的抗體結合片段偶聯（參見，例如，美國專利申請公開號2002/0025313)， 和將抗體或抗原-結合片段包被在低密度脂蛋白顆粒（參見，例如，美國專利申請公開號 2004/0204354)或載脂蛋白E(參見，例如，美國專利申請公開號2004/0131692)中。
[0168] 將抗體或抗原_結合片段跨血腦屏障轉運的基于受體和通道的方法包括，但 不限于，使用糖皮質激素阻斷劑以增加血腦屏障的滲透性（參見，例如，美國專利申請[0169] 為了預防或治療疾病，本發明抗體的合適劑量（當單獨或與一種以上其它另外的 治療劑使用時）將依賴于要治療的疾病類型、抗體類型、疾病的嚴重度和進程、是否施用抗 體用于預防或治療目的、之前的治療、患者的臨床史和對抗體的反應和主治醫師的判斷。抗 體適于一次或經一系列治療施用于患者。根據疾病的類型和嚴重度，約lyg/kg至15mg/ kg(例如0.lmg/kg-10mg/kg)的抗體可以是施用于患者的起始候選劑量，不論例如，通過一 次以上分開的施用，或通過連續輸注。根據上文提到的因素，一個典型的每日劑量可以范圍 從約1yg/kg至100mg/kg或更多。對于經多日或更長時間的重復施用，根據狀況，治療將 通常持續，直到發生對疾病癥狀的所需抑制。一種示例性的抗體劑量范圍將從約0. 05mg/ kg至約 10mg/kg。因此，一種以上約 0? 5mg/kg、2. 0mg/kg、4. 0mg/kg或 10mg/kg(或其任意 組合）的劑量可以施用于患者。這種劑量可以間歇地施用，例如每周或每三周（例如這樣， 患者接受約二至約二十，或例如約六個劑量的抗體）。可以施用更高的起始加載劑量，接著 一次以上更低的劑量。示例性的劑量給藥方案包含施用。然而，其它劑量給藥方案可以是 有用的。該治療過程容易通過常規技術和測定監測。
[0170] E.制造的物品
[0171] 在本發明的另一個方面中，提供含有用于治療、預防和/或診斷上文所述的疾病 的材料的制造的物品。制造的物品包含容器和容器上或與容器相關的標記或藥品說明書。 合適的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由多種材料比如玻璃或 塑料形成。容器裝有組合物，所述組合物為自身或與有效用于治療、預防和/或診斷疾病的 另一種組合物組合并且可以具有無菌接入口（例如容器可以是具有可由皮下注射針頭刺 破的塞子靜脈內溶液帶或小瓶）。組合物中至少一種活性試劑是本發明的抗體。標記或藥 品說明書表明所述組合物用于治療特別的疾病。此外，制造的物品可以包含（a)第一容器， 其中含有組合物，其中所述組合物包含本發明的抗體；和（b)第二容器，其中含有組合物， 其中所述組合物包含進一步的細胞毒素的或另外的治療劑。本發明的該實施方案中的制造 的物品還可以包含藥品說明書，其表明所述組合物可以用于治療特定疾病。備選地，或此 外，制造的物品還可以包含第二（或第三）容器，所述容器包含藥用緩沖液，比如用于注射 的抑菌水（BWFI)、磷酸鹽緩沖鹽水、林格溶液和葡萄糖溶液。其還可以包括從商業和用于的 角度所需的其它材料，包括其它緩沖液、稀釋劑、過濾器、針頭和注射器。
[0172] III.實施例
[0173] 以下是本發明方法和組合物的實例。要理解，已知上文提供的一般描述，可以進行 各種其它實施方案。
[0174] 材料和方法
[0175] 以下材料和方法用于下文所述的實施例。
[0176] 小鼠模型-如Ghosh，A.S?等人（2011)，Watkins，T.A?等人（2013)，Lewcock， J.W?等人Neuron56,604-620 (2007)，和Sabapathy，K?等人Currentbiology:CB9， 116-125(1999)所述，產生DLK雜合和敲除小鼠，DLK條件敲除小鼠，Phrlmag小鼠，和JNK2 敲除小鼠。JNK3 敲除小鼠在C57B1/6ES細胞中通過genOway(Lyon，Francewww.genoway. com)通過與靶載體同源重組產生。靶載體含有3. 8kb和6. 5kb的同源臂并且以新霉素抗 性盒替代外顯子11的大部分。刪除的區域包括JNK活性所需的T-P-Y三肽雙磷酸化基序。 當外顯子10和12剪接在一起時，neo盒插入產生移碼，在外顯子14產生早期終止子。通 過PCR和DNA印跡篩選新霉素抗性ES細胞克隆以證實盒的同源重組。JNK3基因型的確定 通過PCR以如下引物進行：
[0177] 引物 1 :5' -CCAGTAACATTGTAGTCAAGTCT-3'（SEQIDN0 :7)
[0178] 引物 2 :5' -TGGTCTTCCGCTTGGTAT-3'（SEQIDNO:8)
[0179] 引物 3 :5' -CGCCTTCTATCGCCTTCT-3'（SEQIDNO:9)
[0180] 引物1和2在WT等位基因中產生249-bp片段并且在K0等位基因中不產生產物。 引物1和3在K0等位基因中產生435-bp片段并且在WT等位基因中無產物。對來自JNK2/3 雙敲除和同窩動物對照的視網膜樣品中的JNK2和JNK3的印跡表明敲除小鼠中JNK2和 JNK3蛋白的喪失（圖12)。
[0181] 由LexiconPharmaceuticals從C57BL/6ES細胞產生USP9X條件敲除小鼠。它們 含有在外顯子31側面具有loxp位點的USP9X等位基因，其編碼催化的Cys1560。Loxp位 點通過同源重組，使用與FRT側面相接的新霉素盒與外顯子31的5'的4. 7kb和3'的4.Okb 的同源臂插入ES細胞中。通過對盒的同源重組的DNA印跡篩選新霉素抗性ES細胞克隆。 將含有在序列兩端加上loxp位點的（floxed)等位基因的小鼠與Flp刪除株雜交以去除新 霉素盒。為了獲得在序列兩端加上loxp位點的USP9X等位基因的可誘導重組，將USP9X條 件敲除小鼠與R〇sa-Cre-ERT2品系（其含有編碼Cre-雌激素受體融合蛋白的構建體插入 rosa基因座的插入物）雜交（Seibler，J?等人Nucleicacidsresearch31，el2 (2003))。 對于DRG實驗，將USPgX^^'Cre-和USP9X1°xp/1°xp;Cre+小鼠雜交用于定時妊娠并且對胚 胎鑒定基因型從而確認存在或不存在Cre。通過將10yM4-羥基他莫西芬（4-OHT，Sigma catalog#H7904)加入細胞48小時來誘導培養的DRGs中的重組。還將4-0HT加入Cre-對 照細胞。
[0182] 原代神經元培養-將背根神經節從胰酶消化（除了在外植體的情況下）的E12. 5 至E13. 5小鼠胚胎解剖出，并且在用聚-d-賴氨酸和層粘連蛋（laminin) (BioCoat，BD)包 被的小室載玻片上，在含有N3補充物、40mM葡萄糖、和25ng/mLNGF的F12培養基中培養。 鋪板后那天，將3iiM阿拉伯呋喃糖酐（AraC，Sigma)加入培養基中，兩天后去除，并且將培 養基用沒有AraC的N3/F12/NGF替代。對于NGF去除實驗，體外4至5天后，將培養基用不 含NGF并含有25yg/mL抗-NGF抗體（Genentech)的培養基替代1至3小時。
[0183] 對于siRNA實驗，使用Amaxanucleofection系統（Lonza)轉染解離的DRGs。JNK3 81尺熟（正義5'-厶〇厶！^6了厶6 11^厶61'〇^八1'1'1'-3'（5￡0 10勵：10)，反義5'-厶咒八6八 CTTGACTACGATGITT(SEQIDN0:11))在Genentech合成（Kim，M.J?等人Neuron56， 488-502(2007))。對照siRNA是來自Dharmacon的 0N-TARGETplus非靶向siRNA#l。
[0184] 蛋白質印跡-通過在冰上孵育30min.將DRG培養物在含有50mMTrispH7. 5、 150mMNaCl、5mMEDTA和0.l%TritonX-100的緩沖液中裂解。通過在冰上孵育30min. 將HEK293T細胞在放射免疫沉淀測定（RIPA)緩沖液中裂解。在RIPA緩沖液中，使用具有 3mm碳化媽珠子（Qiagen)的TissueLyser(Qiagen)將視網膜和神經組織樣品裂解6min。除 非另有說明，所有裂解液含有完全蛋白酶抑制劑混合物和PhosSTOP磷酸酶抑制劑混合物 (Roche)。293T和視網膜裂解產物的蛋白濃度通過BCA測定（Pierce)來確定。將樣品加在 在NuPAGE4-12%Bis-Tris凝膠上（Invitrogen)并進行標準免疫印跡步驟。除了指出的 情形外，用于DLK印跡的凝膠在MOPS緩沖液（Invitrogen)中電泳（run)。由于Phrl的大 尺寸，用于Phrl印跡的樣品在3-8%Tris-醋酸鹽凝膠（Invitrogen)上電泳。利用化學發 光和暴露于膜將印跡可視化。對于相對蛋白表達和分子量定量，還在Chemidoc(Bio-Rad) 上將印跡可視化。將定量（Bio-Rad)上進行。將蛋白表達針對上樣對照（肌動蛋白或微管 蛋白）標準化。將分子量相對于PrecisionPlusProteinWesternCStandards(Bio-Rad) 標準化。
[0185] 抗體和抑制劑_使用以下抗體用于染色和蛋白質印跡：抗_DLK(1 : 1000,在 Genentech根據參考文獻Hirai，S?等人Development129,4483-4495(2002)制備）； 抗-P_JNK(1 : 250，CellSignaling#9251);抗-p-cjun(用于蛋白質印跡：1 : 250 并且 用于染色：1 : 500，CellSignaling#9261);抗-總JNK(1 : 500，CellSignaling#9252); 抗-JNK2(1 : 500，CellSignaling#4672);抗-JNK3(1 : 500，CellSignaling#2305); 抗-0-微管蛋白（"Tuj"，l: 1000，Covance#MMS-435P-250);抗-肌動蛋白（1 : 5000，BD#612656);抗-切割的-胱天蛋白酶-3(1 : 500，CellSignaling#9664) ;Brn3(l: 100， SantaCruzBiotechnology#sc_6026);y-突觸核蛋白（1 : 200，Abcam#ab55424); NF-M(1 : 200,CovanceMMS-583S)。抗-USP9X(大鼠單克隆 4B3)在Genentech制 備并且針對人USP9X的198C-末端氨基酸產生。針對Phrl的抗體通過用包含氨基酸 D3812-Q3961(其由D0C結構域構成，在桿狀病毒中表達）的Phrl片段免疫兔來產生。然 后使用加載有使用前的相同肽的柱子將血清親和純化。蛋白的該部分在Phrlmag突變體 中缺失。針對DLK上T43、S272和S533磷酸化位點的抗體通過用以下肽免疫兔來產生： PEKDL-pT-PTHVLQLHC(SEQIDNO：12),HRDLK-pS-PNMLITYDC,RNVPQKL-pS-PHSKRPC(SEQID NO:13)并且在使用前親和純化。
[0186] 以給定濃度使用以下抑制劑：放線菌酮（5yM，Calbiochem#239764);大田軟 海綿酸（"〇A"，200nM，Sigma#08010)，MG132(30yM，Fisher_C9937881)JNK抑制劑 V( "JNKV"，10yM，EMD#420129);JNK抑制劑VII( "JNKVII"，10yM，EMD#420134);JNK抑制 劑VIII( "JNKVIII"，10yM，EMDM20135)。
[0187] 使用HA-Ub-乙烯基砜的USP9X活性測定-HA-標記的泛素乙烯基砜獲自EnzoLife Sciences。如在Borodovsky，A?等人Chemistry&biology9，1149_1159(2002)中的進 行所述測定。簡言之，將培養的DRGs用抗-NGF或用NGF作為對照來處理。然后將DRGs重 懸在裂解緩沖液（50mMTrispH7.5、5mMMgCl2、250mM蔗糖、ImMDIT、2mMATP、和 100yM PMSF)中并且勻漿以裂解。然后將裂解產物與6.6yg/mLHA-泛素乙烯基砜在25°C孵育2 小時。將N-乙基-馬來酰亞胺以5yM加入，作為陰性對照。過在樣品緩沖液中煮沸來終 止反應。
[0188] 實時定量逆轉錄PCR(Real-Time qRT-PCR)-使用RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen)收集來自解離的DRGs和視網膜的RNA樣品。從Applied Biosystems 訂購預先設計的Taqman引物組。引物組的目錄號如下：DLK-Mm00437378_ml (FAM標 記），GAPDH-4352339E(VIC標記）。使用Taqman RNA-to-Ct 0ne-St印Kit(Applied Biosystems#4392938)在7500Real-Time PCR系統上進行比較Ct(A ACt)測定并且在7500 軟件行分析。GAPDH內源對照和DLK引物多重使用。所有測定包括五個技術重復。誤差線 表示從這五個技術重復計算的相對量的標準偏差。
[0189] X蛋白磷酸酶測定-A蛋白磷酸酶、用于PMP的10XNE緩沖液和10mMMnCl#^ 獲白NewEnglandBiolabs。對于DRGs，在無磷酸酶抑制劑或EDTA，但在別的方面與本稿件 中的其他DRG裂解產物相同的條件下收集裂解產物。將裂解產物與IXPMP緩沖液和ImM MnCl2，與800單位的A蛋白磷酸酶或相當體積的50%甘油作為對照在30°C孵育30min。通 過與樣品緩沖液一起加熱并加載在凝膠上來終止反應。
[0190] 確定DLK穩定性的放線菌酮時間進程-在時間0，將DRG培養基用不含NGF、抗-NGF 和放線菌酮的培養基替代，如在之前方法副標題中詳述的。在給定時間點收集裂解產物并 對DLK印跡。將實驗進行三次并且將DLK相對于上樣對照定量。對于各個時間點，計算相 對于時間0DLK的平均量。線性回歸和統計分析以比較兩條線的斜率，在GraphpadPrism 軟件中進行。
[0191] 免疫沉淀-對于抗-泛素免疫沉淀（IPs)，如之前所述，將從E12. 5⑶-1小鼠 (Charles River Laboratories)解剖的DRGs裂解，并且在裂解緩沖液中加入30 yM MG132和5yM N-乙基馬來酰亞胺。將裂解產物用蛋白G綴合的Dynabeads (Life Technologies) 預清除30min.。6yg抗-泛素抗體（克隆FK2, Millipore)或相當物。
[0192] 體外JNK激酶測定-使用抗-Flag-綴合的磁珠（Sigma)將Flag-標記的DLKS3°2A 從293T細胞裂解產物免疫沉淀。洗滌后，將結合DLK的Flag珠子與2, 000單位的A蛋白 磷酸酶、IXPMP緩沖液、和IX1111(：12在30°C孵育30min.以從純化的DLK去除所有磷酸根 基團。然后將珠子用含有磷酸酶抑制劑的緩沖液洗滌并且用激酶反應緩沖液（50mMHEPES pH7.2，10mMMgCl2、lmMEGTA、0.01%Triton-X-100、2mMDTT、30yMATP)分為兩管。將 126ngGST-標記的人重組JNK3(Millipore)加入兩管中的一管中并且將它們在30°C孵育 90min。通過在樣品緩沖液中加熱，將DLK從Flag珠子洗脫，并且將樣品上樣于凝膠用于印 跡。
[0193] 實施例1-神經元應激應答導致各種哺乳動物應激范例中DLK水平增加
[0194] 檢測總DLK蛋白水平以確定總DLK水平是否隨著對神經元應激的一般響應而增 加，如在無脊椎動物（Xiong，X?等人（2010))和基于細胞培養的模型（Xu，Z?等人（2001)) 中所觀察到的。選擇兩種神經元應激模型（其產生可靠的和可重復的DLK依賴性的神經 變性）：培養的胚胎感覺神經元的神經生長因子（NGF)去除測定，發育的神經元細胞死亡模 型，和視網膜視神經擠壓測定，神經損傷和青光眼模型3' 18。與未應激的在NGF的存在下培 養的神經元相比，在培養的胚胎背根神經節細胞（DRGs)中，DLK蛋白水平響應NGF去除，以 大約2-倍增加（圖la，e)。類似地，在視神經擠壓