特性（結果未示出）。以上兩 種iDNA質粒用于創造帶有結構蛋白基因相互交換的嵌合構建體。圖3中顯示了此類嵌合 物之一 pCMV[CprMEm99]WN956,其衍生物被發明人用在正在進行的人減毒西尼羅疫苗的開 發中。其攜帶385-99的所有結構蛋白，取代WN956的那些，并將前者的高免疫原性和后者 的減毒表型組合。
[0077] 實施例3 :影響病毒感染性的突變的鑒定
[0078] 如上所述，高度保守的序列GSQEG形成E二聚體中基本回文的中心單體接觸界面。 在建模實驗中，選擇了幾個可能增強在這一接觸界面處的相互作用，并影響對病毒感染性 至關重要的pH介導的二聚體解離的突變。
[0079] 基本原理：選擇可能增強單體和單體相互作用的突變。中心接觸界面的回文性質 起源于所述二聚體的二次對稱性，其可以在圖2A中的頂視圖中看到。圖2B和2C的展開圖 顯示在野生型蛋白中，GSQEG序列形成高度對稱的接觸。這一對稱的保存作為重要的因素 包括在我們的建模實驗中。也就是說，無法采用側鏈構象來形成對稱或近似對稱界面的氨 基酸被排除。通常來說，未研宄將在此接觸界面干擾單體-單體相互作用的突變。預期此 類突變有害于病毒粒體的組裝是合理的。與此相反，加強兩個單體之間相互作用的突變可 能具有對病毒粒體組裝可以忽略的影響，但對所述二聚體的解離產生不利影響。接觸界面 的對稱性意味著GSQEG序列中的單個突變由于各條鏈的貢獻將導致界面處的雙重效果。
[0080] 高度保守的帶負電氨基酸的存在（對于蚊媒黃病毒為E而對于蜱媒亞組為D)促 進了關于接觸界面處的單體相互作用是否能夠通過引入能夠與其形成鹽橋的帶正電荷的 氨基酸來增強的研宄。如上所述，Gln-258側鏈暴露于圖2圖平面的背側，其潛在的相互作 用伴侶沒有鑒定。然而，一條鏈中的Gly-256和Ser-257兩者似乎與另一條鏈中的Glu-259 的側鏈緊密靠近，促使對這些位置的突變的探宄。對Ser-257被Arg或Lys取代的E突變 蛋白建模示于圖4A和4B中。顯然Arg-257或Lys-257都不能形成對稱的界面。為了改善 側鏈的對稱性，通過操作扭轉角（使用SwissProt DeepView 3.7)在兩條鏈處的折疊由于 原子之間的多沖突而沒有成功（結果未示出）。雖然Arg-257可以稍微更好的納入，產生的 排列表明各個鏈中的Arg-257側鏈似乎與同一條鏈的Glu-259側鏈靠近。因此，所期待的 兩條鏈之間的潛在鹽橋不能形成。
[0081] 使用Arg或Lys取代Gly-256的E突變蛋白建模產生了較令人鼓舞的結果。產生 的RSQEG(圖5A)和KSQEG(圖5B)似乎形成近似對稱的接觸界面，扭轉角的操作產生了幾 種具有改善的對稱性，沒有原子之間沖突的旋轉異構體（結果未示出）。最重要的是，一條 鏈中的Arg-256和Lys-256的側鏈似乎都靠近另一條鏈中的Glu-258側鏈，因此能夠在鏈 之間形成所需的鹽橋。如上所述，單個突變將導致在回文接觸界面任一端的兩個鹽橋的形 成。由于這個原因，選擇Gly256Arg和Gly256Lys突變來探宄其在NY99E蛋白二聚體的形 成和行為，以及NY99病毒的生物學特性上的影響。
[0082] 實施例4 :突變構建體回復的設計和突變病毒的生物學特性
[0083] 為了檢查所述修飾的減毒效果，Gly256Arg和Gly256Lys突變如圖3所示引入 PCMVNY99感染性DNA構建體中。作為對比，GSQEG序列（發現于蚊媒病毒中）改變為蜱媒 病毒特征性的GDQTG。所述pCMVNY99質粒當轉染哺乳動物細胞時和直接接種小鼠后，通常 均產生高感染性和高毒性的NY99病毒。后者在通過任意途徑接種少至Ipg的感染性DNA 后（i. m.，i. d.，i. c.)，導致動物100%的死亡率。
[0084] 如圖6所示，兩種加強二聚體的突變對病毒的感染性有顯著的影響，導致病毒在 感染的哺乳動物細胞中與產生于野生型構建體的NY99病毒相比傳播延遲。于此相反，蜱媒 黃病毒構造的插入對病毒的感染性沒有明顯影響。
[0085] 突變衍生物的毒性在成年小鼠腦內接種模型中測試。由6只5-6周齡的小鼠的組 i. c接種pCMVNY99的1 μ g G256R、G256K或（S257D，E259T)衍生物，并對于死亡率觀察動 物21天。垂死的動物使其安樂死并算作死于感染，使用病毒特異性RT-PCR通過病毒在腦 中的存在確定。與感染試驗一致，（S257D，E259T)突變體為高毒性，在接種后5天殺死了所 有動物。與之相反，在G256R、G256K組僅各有兩只小鼠發現垂死并使其安樂死；然而，通過 RT-PCR對病毒在腦中存在的揭示沒有進行。不過假設動物死亡是由感染引起的，在腦內接 種這樣一個嚴格的測試中67%的存活率表明兩種突變病毒的高減毒水平。所有存活的動物 表現出高水平的NY-99特異性抗體，其終點稀釋滴度超過1:2560,表明所述動物確實暴露 于感染性DNA。
[0086] 從上述將可以看出本發明很好的適用于本文以上所述的所有目的和目標，以及其 它對于本發明是固有的和顯而易見的優點。由于不脫離本發明的范圍，可以做出許多可能 的實施方案，應當理解本文所述的或示于附圖的所有事項都被解釋為說明性的，而不具有 限制意義。雖然示出了和討論了具體的實施方案，但當然可能進行各種修改，并且本發明不 限于本文所述部分和步驟的具體形式或排列，除了包括于以下的權利要求中的相關限制。 此外，應當理解某些特征和子組合是有用的，并且在不參考其它特征和子組合下可以采用。 這被考慮并在權利要求的范圍內。
[0087] 以下參考文獻，在某種程度上提供示例性的步驟或其它細節補充到本文所述中， 通過提述具體并入本文。
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