個氨基酸的差異。占 主導地位的減毒效應與定位在結構域I和II界面處的被稱為"鉸鏈"區的E138K突變相關 聯（見 Rey 等，The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2A resolution，Nature 375 291-298(1995))。鉸鏈位點被認為在與病毒進入相關的E蛋 白二聚體向三聚體的轉化中扮演關鍵角色。在這個區域中的修飾調節黃病毒在小鼠中的毒 性（見 Cecilia 等，Nucleotide changes responsible for loss of neuroinvasiveness in Japanese encephalitis virus neutralization-resistant mutants, Virology 181 70-71 (1991) ；Gualano 等，Identification of a major determinant of mouse neurovirulence of dengue virus type 2using stably cloned genomic-length cDNA, J Gen Virol 79 437-446 (1998) ;Hasegawa 等，Mutations in the envelope protein of Japanese encephalitis virus affect entry into cultured cells and virulence in mice,Virology 191 158-165(1992) ;Hurrelbrink 等，Attenuation of Murray Valley encephalitis virus by site-directed mutagenesis of the hinge and putative receptor-binding regions of the envelope protein,J Virol 75 7692-7702(2001)； McMinn 等，Murray valley encephalitis virus envelope protein antigenic variants with altered hemagglutination properties and reduced neuroinvasiveness in mice,Virology 211 10-20(1995)；和 Sumiyoshi 等，Characterization of a highly attenuated Japanese encephalitis virus generated from molecularly cloned cDNA, J Infect Dis 171 1144-1151 (1995)，其全部通過提述并入本文）。對于毒性的減輕或回復 重要的其它位點鑒定為在E中的位置176/177和264/279,其也存在于SA14-14-2中。前 者定位于中心結構域，其在病毒進入期間在酸介導的E蛋白重排成融合活性三聚體期間經 歷改變（見 Bressanelli 等，Structure of a flavivirus envelope glycoprotein in its low-pH-induced membrane fusion conformation, EMBO J 12 1-12 (2004) )〇 后一位 置也定位于鉸鏈區，并可能功能上與通過E138K突變確定的位點協作，由于涉及附近位置 的突變損害E蛋白的血凝和融合特性，并降低在小鼠中的神經侵襲性（見Hurrelbrink等， Attenuation of Murray Valley encephalitis virus by site-directed mutagenesis of the hinge and putative receptor-binding regions of the envelope protein, J Virol 75 7692-7702(2001)和 McMinn 等，Murray valley encephalitis virus envelope protein antigenic variants with altered hemagglutination properties and reduced neuroinvasiveness in mice，Virology 211 10-20 (1995))。存在于 SA14-14-2 中最后的突 變集群定位于E蛋白的結構域III和莖-錨區，其對于病毒附著細胞和與prM相互作用重 要。位置315周圍的突變導致改變的病毒趨向性和毒性的變化（見Jennings等，Analysis of a yellow fever virus isolated from a fatal case of vaccine-associated human encephalitis，J Infect Dis 169 512-518(1994) ;Jiang 等，Single amino acid codon changes detected in louping ill virus antibody-resistant mutants with reduced neurovirulence,J Gen Virol 74 931-935 (1993) ；Ni 等，Attenuation of Japanese encephalitis virus by selection of its mouse brain membrane receptor preparation escape variants, Virology 241 30-36 (1998)；和 Ryman 等，Mutation in a 17D-204vaccine substrain-specific envelope protein epitope alters the pathogenesis of yellow fever virus in mice, Virology 244 59-65 (1998)) 〇 壟-錨 區的完整性對于prM-E異質二聚體的穩定性也是必須的（見Allison等，Mapping of functional elements in the stem-anchor region of tick-borne encephalitis virus envelope protein E，J Virol 73 5605-5612(1999))。SA14-14-2 中在遠端單體接觸界 面發現的唯一氨基酸改變（見圖I)涉及高度保守的融合環（氨基酸98-110)中的L107F 取代。在絕大多數的黃病毒中，這一位置被Leu占據，除了在TBE病毒的毒性大大降低的 美洲親屬波瓦森（Powassan)和鹿蜱黃病毒中出現Phe的僅有的兩個已知例外。將這一突 變回復為Leu與神經毒性表型的僅部分回復相關聯（見Arroyo等，Molecular basis for attenuation of neurovirulence of a yellow fever Virus/Japanese encephalitis virus chimera vaccine (ChimeriVax-JE)，J Virol 75 934-942 (2001))，表明在該位點僅 承受輕微的減毒改變。在遠端或中心接觸界面其它已知突變的缺乏表明存在針對影響二聚 體形成改變的強大選擇壓力。這與這一接觸界面對于病毒感染周期結束時病毒粒體組裝/ 成熟，以及在下一個繁殖周期的初始階段病毒粒體的功能性解組裝的重要性一致。
[0010] 發明簡述
[0011] 本發明涉及黃病毒包膜蛋白中心單體接觸界面中的突變，其調節所述黃病毒的傳 染性。所述突變顯著的降低了病毒感染宿主細胞的能力，導致病毒傳播的延遲或抑制。與 以前描述的突變不同，這些突變典型的不影響病毒復制或組裝以及從感染的細胞釋放傳染 性病毒粒體。相對地，組裝和釋放的病毒粒體在向前-融合（pre-fusogenic)狀態的轉變 中被抑制，該轉變對于許多的（如果不是全部的）包膜病毒是在作為融合介導的病毒進入 宿主細胞之前特征性的中間狀態。產生的病毒保持了高免疫原性，然而由于其不能建立高 效的病毒血癥而很大程度上更安全。該方法打開了合理設計保留與親本病原體相似的免疫 原性的安全減毒疫苗的可能性。
[0012] 因此，在一個方面，本發明涉及能夠沿著高度保守的中心單體接觸界面形成二聚 體的黃病毒包膜單體蛋白中的一個或多個突變。所述黃病毒的中心單體接觸界面對應于西 尼羅病毒包膜蛋白的氨基酸256至260。所述包膜蛋白具有中心單體接觸界面中一個或多 個突變，其降低二聚體的解離。在另一個方面，所述黃病毒包膜單體蛋白中的一個或多個 突變導致在中心單體接觸界面的至少兩個鹽橋。在一個示例性的方面，對于蚊媒病毒，對應 于西尼羅病毒包膜蛋白位置256處發現的甘氨酸的黃病毒氨基酸被堿性氨基酸取代，例如 賴氨酸或精氨酸。在另一個示例性的方面，對于蜱媒病毒，對應于西尼羅病毒包膜蛋白位置 260處發現的甘氨酸的黃病毒氨基酸被堿性氨基酸取代，例如賴氨酸或精氨酸。
[0013] 另一個方面，本發明涉及黃病毒包膜單體蛋白，其具有包含選自下組序列的中 心單體接觸界面：RSQEG(SEQ ID N0:1)、RNQEG(SEQ ID N0:2)、⑶QTR(SEQ ID N0:3)、 KSQEG (SEQ ID NO:4)、KNQEG (SEQ ID NO:5)、和⑶QTK (SEQ ID NO: 6)。
[0014] 在優選的方面，具有所述創造性突變的黃病毒選自西尼羅病毒、昆津病毒（Kunjin virus)、日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus)、墨累谷腦炎病毒（Murray Valley encephalitis virus)、登革熱血清型 1 病毒（dengue serotype lvirus)，登革熱血清型 2 病毒（dengue serotype 2virus)，登革熱血清型 3 病毒（dengue serotype 3virus)，登革 熱血清型 4 病毒（dengue serotype 4virus)，黃熱病病毒（yellow fever virus)、蜱媒腦 炎病毒（tick-borne encephalitis virus)、波瓦森病毒（Powassan virus)以及鄂木斯克 出血熱病毒（Omsk hemorrhagic fever virus) 〇
[0015] 在另一個方面，本發明涉及編碼具有創造性突變的黃病毒包膜單體蛋白的多核苷 酸。本發明也涉及包含所述多核苷酸的載體，以及具有此類載體的宿主細胞。
[0016] 再一個方面，本發明涉及活減毒黃病毒，其編碼具有本文描述的創造性突變的黃 病毒包膜二聚體蛋白。在優選的方面，所述黃病毒選自西尼羅病毒、昆津病毒、日本腦炎病 毒、墨累谷腦炎病毒、登革熱血清型1病毒，登革熱血清型2病毒，登革熱血清型3病毒，登 革熱血清型4病毒，黃熱病病毒、蜱媒腦炎病毒、波瓦森病毒以及鄂木斯克出血熱病毒。另 一個方面，所述創造性突變在活嵌合黃病毒中。所述病毒（嵌合或非嵌合）可選的具有一 個或多個包膜蛋白突變，例如對應于西尼羅病毒包膜蛋白選自下組氨基酸的氨基酸殘基中 的突變：氨基酸 107、138、176、224、264、280、316 和 440。
[0017] 再一個方面，本發明涉及包含編碼具有本文描述的創造性突變的黃病毒包膜二聚 體蛋白的減毒黃病毒的免疫原性組合物。此類組合物可以用于施用于患者，包括人。施用 的示例性途徑包括靜脈內、肌肉內、腹膜內，或皮下。
[0018] 在另一個方面，本發明涉及編碼具有本文描述的創造性突變的包膜二聚體蛋白的 黃病毒的重組遺傳構建體。所述重組遺傳構建體可以包含載體例如質粒。在一個方面，所 述重組遺傳構建體是編碼真核啟動子控制下的感染性（+)RNA分子的感染性DNA。此類重組 遺傳構建體可以編碼對應的重組蛋白。在另一個方面，本發明涉及穩定或瞬時轉染有所述 重組遺傳構建體的宿主細胞。
[0019] 再一個方面，本發明涉及包含編碼具有本文描述的創造性突變的黃病毒包膜二聚 體蛋白的重組遺傳構建體的免疫原性組合物。再一次，此類組合物可以用于施用于患者，包 括人。施用的示例性途徑包括靜脈內、肌肉內、腹膜內，或皮下。
[0020] 本發明的另外的方面，其附屬的優點和新穎特征于此一起，將部分闡述于隨后的 說明書中，并且部分的將通過檢查下文對于本領域的技術人員變得顯而易見，或從本發明 的實施中了解。本發明的目的和優點可以通過隨附的權利要求中具體指出的手段和聯合實 現。
[0021] 附圖簡述
[0022] 圖1是NY99E蛋白胞外域的三維模型。所述模型由同源建模制成。所述結構域的 邊界通過橢圓形和相鄰的數字指示。
[0023] 圖2是NY99E蛋白胞外域的預融合二聚體形式。A組是所述二聚體的頂視圖，其 蛋白骨架顯示為實心色帶。B組和C組顯示了A組中的中心接觸界面的展開圖。上面鏈的 N - C方向為從左上前方到右上后方；下面鏈的N - C方向為從右下前方到左下后方。接 觸界面處的氨基酸以示意圖示出（B組），或以空間填充表示（C組）。為了清楚，后者的序 列輪廓不完全遵循多肽骨架。也就是說，氨基酸字母的位置并不遵循多肽骨架，其通過相鄰 氨基酸的- a C-N-a C-N-a C-原子相連來追蹤，因為并不是骨架中的所有氨基酸在空間填 充表示中都清晰可見。
[0024] 圖3是本發明使用的感染性DNA構建體的示意圖。δ -肝炎δ核酶序列；BG-牛 生長素轉錄終止和多聚腺甘酸化信號序列；CMV-巨細胞病毒啟動子/增強子序列；bla-氨 芐青霉素抗性基因；〇ri_pBR322復制起點；i2383和i358/393標記內含子的位置。單個元 件沒有按照比例繪制。
[0025] 圖4是帶有Ser257Arg(A組）和Ser257Lys (B組）突變的NY99E蛋白胞外域的預 融合二聚體形式的三維模型。同源建模使用SwissModel和坐標文件Η)Β#10ΑΝ和H)B#1UZG 進行。
[0026] 圖5是帶有Gly256Arg(A組）和Gly256Lys(B組）突變的NY99E蛋白胞外域的預 融合二聚體形式的三維模型。同源建模使用SwissModel和坐標文件Η)Β#10ΑΝ和H)B#1UZG 進行。
[0027] 圖6是野生型和突變病毒的感染特性的模型。玻璃蓋玻片上的BHK細胞使用相應 的感染性DNA轉染，細胞在所示的時間固定并使用WN特異性抗血清隨后抗小鼠 IgG-FITC 綴合物染色。
[0028] 圖7圖表顯示了在腦內接種1 μ