影響病毒粒體解組裝的黃病毒包膜蛋白突變的制作方法
【專利說明】影響病毒粒體解組裝的黃病毒包膜蛋白突變
[0001] 對相關申請的交叉引用
[0002] 本申請基于并要求2012年11月7日提交的美國非臨時申請流水號13/671,111 的優先權,其內容通過提述并入本文。
[0003] 發明背景
[0004] 黃病毒屬包含超過60種緊密相關的病毒,包括幾種具有全球和地域性傳染病學 重要意義的人類病原體。病毒粒體由三種結構蛋白構成,命名為衣殼(capsid) ( "C"),被 膜(membrane) ( "M")以及包膜(envelop) ( "E")。在被感染的細胞中發現的未成熟的黃 病毒粒體含有前被膜("prM")蛋白,其為M蛋白的前體。未成熟的病毒粒體含有prM-E異 質二聚體,構成病毒粒體包膜。prM蛋白作為緩慢折疊的E的伴侶蛋白,阻止E在運輸過程 中PH介導的不可逆重排,并在病毒粒體釋放前被切割。黃病毒感染的細胞釋放非感染性的 亞病毒顆粒,其僅包含包膜蛋白PrM和E。這些可以通過表達黃病毒prM-E基因盒產生。其 組裝途徑-細胞內運輸、碳水化合物處理、成熟、prM切割以及分泌-與感染性病毒粒體類 似。
[0005] E蛋白包含一段長的胞外域,緊跟著一段莖-錨區。對于蜱傳腦炎和登革熱病毒 的E蛋白,其黃病毒E蛋白胞外域(約400個氨基酸,不包括羧基末端的莖和跨膜域)以 及其二聚和三聚形式無論在融合前和融合后構象的三維結構已經解析。見Bressanelli 等,Structure of a flavivirus envelope glycoprotein in its low-pH-induced membrane fusion conformation, EMBO J 12 1-12(2004) ;Modis 等,A ligand-binding pocket in the dengue virus envelope glycoprotein, Proc Natl Acad Sci USA 100 6986-6991 (2003)Epub May 20,2003 ;Modis等,Structure of the dengue virus envelope protein after membrane fusion, Nature 427 313-319 (2004) ;Modis 等,Variable surface epitopes in the crystal structure of dengue virus type 3envelope glycoprotein,J Virol 79 1223-1231 (2005);以及 Rey 等,The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2A resolution, Nature 375 291-298(1995), 其通過提述并入本文。胞外域形成方向平行于病毒被膜的細長二聚體(見圖1,通過同源 建模得到的NY99E400模型的頂視圖)。在頭-尾二聚體中,每一個單體由結構域I、II和 III構成。二聚體中的單體接觸不是沿著分子的整個長度連續的。在二聚體軸中存在兩 個孔占據切割的 prM 的位置(見 Rey 等,The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2A resolution,Nature 375 291-298(1995))。除了結構域II 中 的兩個短的α螺旋外,整個分子中β鏈是主要的。
[0006] 每一個位于中心的N端結構域I含有兩個二硫鍵,并帶有單個碳水化合物 側鏈,其屏蔽位于結構域II尖端的融合肽,并有助于所述二聚體的整體穩定性(見 Rey 等,The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2A resolution,Nature 375 291-298 (1995))。結構域II,或二聚化結構域,具有細長的指狀結 構,并在兩個不同的位點參與單體與單體的相互作用。遠端環通過三個二硫鍵穩定,并形成 容納融合肽的尖端,其納入由第二個單體的結構域I和III提供的疏水口袋中。這一接觸 很大程度上是非極性的,并由來自一個亞基上的結構域I和III的殘基和另一個亞基上的 結構域II的尖端組成。在中心處的接觸,其中可以看到兩個突出的α螺旋,主要只涉及結 構域II的疏水側鏈。結構域III含有C端,并在病毒粒體中連接到莖,隨后是將單體錨定 在被膜中的跨膜區。
[0007] 盡管在不同的黃病毒中E蛋白氨基酸序列的差異,12個半胱氨酸殘基在物種之間 絕對保守。在西尼羅病毒(West Nile virus)E蛋白中,這些半胱氨酸殘基形成六個二硫 鍵(見 Nowak 等,Analysis of disulfides present in the membrane proteins of the West Nile flavivirus, Virology 156 127-137 (1987)),并在所有目前已確定的 E 蛋白的 X射線結構中,在預期的位置被發現。這有力的支持了對于所有黃病毒E蛋白,其整體結構 構造和折疊是相似的這一目前理解。
[0008] 暴露于酸性pH導致病毒粒體構造的大量重排,伴隨著生物學活性例如感染性、 膜結合和融合的失活。在病毒進入期間,誘導的改變是融合過程的關鍵組分。見Corver 等,Membrane fusion activity of tick-borne encephalitis virus and recombinant subviral particles in a liposomal model system, Virology 269 37-46(2000) ;Heinz 等,The machinery for flavivirus fusion with host cell membranes, Curr Opin Microbiol 4 450-455(2001);和Stiasny等,Membrane interactions of the tick-borne encephalitis virus fusion protein E at low pH, J Virol 76 3784-3790(2002)。E 蛋白介導的pH誘導的融合機制涉及E從二聚體到三聚體形式的重排(見Stiasny等, Structural requirements for low-pH-induced rearrangements in the envelope glycoprotein of tick-borne encephalitis virus, J Virol 70 8142-8147(1996))。融 合(fusogenic)E三聚體的形成是一個兩步的過程,其中二聚體首先在低pH的影響下解離, 然后重新聯合形成三聚體。所述兩步模型首先在E-400胞外域的研宄中獲得。在莖-錨區 不存在時,暴露于酸性PH導致二聚體的可逆解離,其不導致三聚化。進一步的研宄揭示了 莖-錨區(約氨基酸400-449)對于溶液中低pH誘導的二聚體向三聚體的不可逆轉化的功 能(見 Allison 等,Mapping of functional elements in the stem-anchor region of tick-borne encephalitis virus envelope protein E,J Virol 73 5605-5612(1999))。 低pH誘導的從二聚體到三聚體的不可逆改變提示在病毒粒體中,E作為亞穩定的二聚體存 在,并當施加適當的觸發時(在這種情況下是低pH)改變為更穩定的三聚體。已證明E的三 聚體形式對熱變性比二聚體形式更穩定。然而,與I類融合蛋白不同,這種向更穩定的構象 的轉變不能通過熱處理誘導,其只能導致E的變性(見Stiasny等,Role of metastability and acidic pH in membrane fusion by tick-borne encephalitis virus, J Virol 75 7392-7398 (2001))。這表明天然E二聚體的質子化對于能量上更穩定的最終三聚體形式的 形成所需的單體中間結構的產生是不可缺少的(見Heinz等,Flavivirus structure and membrane fusion, Adv Virus Res 59 63-97(2003))。
[0009] 對于許多黃病毒,神經毒性和神經侵襲表型與包膜蛋白有關。見Cecilia 等,Nucleotide changes responsible for loss of neuroinvasiveness in Japanese encephalitis virus neutralization-resistant mutants, Virology 181 70-71 (1991) ;Chambers 等,Yellow fever/Japanese encephalitis chimeric viruses: construction and biological properties, J Virol 73 3095-3101(1999); Gualano 等,Identification of a major determinant of mouse neurovirulence of dengue virus type 2using stably cloned genomic-length cDNA,J Gen Virol 79 437-446(1998) ;Hasegawa 等,Mutations in the envelope protein of Japanese encephalitis virus affect entry into cultured cells and virulence in mice, Virology 191 158-165 (1992) ;Holzmann 等,A single amino acid substitution in envelope protein E of tick-borne encephalitis virus leads to attenuation in the mouse model, J Virol 64 5156-5159(1990) ;Holzmann 等,Characterization of monoclonal antibody-escape mutants of tick-borne encephalitis virus with reduced neuroinvasiveness in mice, J Gen Virol 78 31-37(1997) ; Jiang 等,Single amino acid codon changes detected in louping ill virus antibody-resistant mutants with reduced neurovirulence, J Gen Virol 74 931-935(1993) ;McMinn, The molecular basis of virulence of the encephalitogenic flaviviruses,J Gen Virol 78 2711-2722 (1997) ;Pletnev 等,Construction and characterization of chimeric tick-borne encephalitis/dengue type 4viruses, Proc Natl Acad Sci USA 89 10532-10536(1992);以及 Pletnev 等,Chimeric tick-borne encephalitis and dengue type 4viruses: effects of mutations on neurovirulence in mice, J Virol 67 4956-4963(1993),其全部通過提述并入本文。然而,基因組其它部分中的突變也涉 及神經毒性的缺失 / 獲得。見 Butrapet 等,Attenuation markers of a candidate dengue type 2vaccine virus, strain 16681 (PDK-53),are defined by mutations in the 5'noncoding region and nonstructural proteins land 3,J Virol 74 3011-3019(2000) ;Duarte dos Santos等,Determinants in the Envelope E Protein and Viral RNA Helicase NS3That Influence the Induction of Apoptosis in Response to Infection with Dengue Type IVirusjVirology 274 292-308(2000) ;Dunster 等,Molecular and biological changes associated with HeLa cell attenuation of wild-type yellow fever virus,Virology 261 309-318(1999) ;Muylaert 等, Mutagenesis of the N-Iinked glycosylation sites of the yellow fever virus NSlprotein: effects on virus replication and mouse neurovirulence, Virology 222 159-168 (1996) ;Ni 等,Molecular basis of attenuation of neurovirulence of wild-type Japanese encephalitis virus strain SA14,J Gen Virol 76 409-413(1995);和 Xie 等,Yellow fever 17D vaccine virus isolated from healthy vaccinees accumulates very few mutations,Virus Res 55 93-99 (1998),其全部通過 提述并入本文。蛋白E中的突變導致的減毒最廣泛的研究使用活減毒JE疫苗SA14-14-2, 其中已經鑒定了 E蛋白中區別減毒疫苗病毒和其毒性親本SA14的9