用于產生重組艾杜糖-2-硫酸酯酶的細胞的制作方法
【專利說明】用于產生重組艾杜糖-2-硫酸酯酶的細胞
[0001]相關申請的奪叉引用
[0002] 本申請要求2012年6月29日提交的美國臨時專利申請系列號61/666, 719的優 先權；其完整內容在此通過引用并入。
[0003] 序列表
[0004]在本說明書提及在2013年6月27日以電子形式提交的命名為"2006685-00340_SEQ_LIST"的ASCII.txt文件的序列表。所述.txt文件于2013年6月25日產生，并且大 小為25KB。將序列表的全部內容通過引用并入本文。
[0005] 背景
[0006]粘多糖貯積癥II型（MPSII，亨特綜合癥）是因酶艾杜糖-2-硫酸酯酶（I2S)的 缺乏而引起的X染色體連鎖隱性溶酶體貯積癥。I2S從葡糖氨基聚糖（GAG)硫酸皮膚素和 硫酸乙酰肝素切割末端2-0-硫酸酯部分。由于亨特綜合癥患者中喪失I2S酶或存在有缺 陷的I2S酶，因此GAG在多種細胞類型的溶酶體中逐漸累積，從而導致細胞腫脹，器官腫大， 組織破壞和器官系統功能障礙。
[0007] -般而言，具有亨特綜合癥的人的身體表現包括軀體和神經癥狀。例如，在亨特綜 合癥的一些病例中，中樞神經系統受累導致發育遲緩和神經系統的問題。而亨特綜合癥的 非神經癥狀在出生時一般不存在，隨著時間的推移，GAG在體內細胞中的漸進累積可能對身 體的外周組織具有巨大影響。GAG在外周組織中的累積導致患者面部特征的鮮明粗糙度，并 且造成前額突出、扁平橋和巨舌，此為亨特綜合征患者的最典型特征。類似地，GAG的累積 可不利地影響身體的器官系統。最初表現為心臟、肺和呼吸道的壁的增厚，以及肝、脾和腎 的異常腫大，這些深刻的變化最終可導致廣泛的災難性器官衰竭。因此，亨特綜合癥總是嚴 重的、進行性的和限制壽命的。
[0008] 酶替代療法（ERT)是用于治療亨特綜合癥（MPSII)的批準的療法，其包括向亨特 綜合癥患者施用外源替代I2S酶。
[0009] 發明概沐
[0010] 本發明除其他事項外提供了用于產生重組I2S蛋白的改進的方法和組合物，所述 重組I2S蛋白允許對于亨特綜合癥的更有效的酶替代療法。本發明涵蓋這樣的發現：可由 經工程化以共表達重組I2S蛋白和甲酰甘氨酸生成酶（FGE)的哺乳動物細胞產生更具效能 的重組I2S蛋白。出乎意料的是，由這種工程化細胞產生的重組I2S蛋白具有異常高水平 的Ca-甲酰甘氨酸（FGly)轉化百分比（例如，大于70%和高達100%)，從而導致重組I2S 蛋白的顯著增強的酶活性。此外，已使根據本發明的共表達I2S和FGE蛋白的哺乳動物成 功地適應在大規模懸浮培養中生長。因此，本發明使得能夠更高效地大規模生產高效能重 組I2S蛋白。
[0011] 因此，在一個方面，本發明提供了包含第一核酸和第二核酸的細胞，所述第一核酸 編碼具有與3￡〇10勵：1具有至少約50%(例如，至少約55%、60%、65%、70%、75%、 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)的同一性的氨基酸序列的艾杜糖-2-硫酸 酯酶（I2S)蛋白，所述第二核酸編碼包含與SEQIDNO:5具有至少約50% (例如，至少約 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)的同一性的 氨基酸序列的甲酰甘氨酸生成酶（FGE)蛋白，其中第一和/或第二核酸是外源的，并且其中 一旦在細胞培養條件（例如，懸浮或貼壁培養）下培養后，細胞產生包含至少約70% (例 如，至少約 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)的對應于5￡0 1〇 NO: 1的Cys59的半胱氨酸殘基至Ca-甲酰甘氨酸（FGly)的轉化的I2S蛋白。
[0012] 在另一個方面，本發明提供了包含第一核酸和第二核酸的細胞，所述第一核酸編 碼具有與SEQIDN0:1具有至少約50% (例如，至少約55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)的同一性的氨基酸序列的艾杜糖-2-硫酸酯酶 (I2S)，所述第二核酸編碼包含與SEQIDNO:5具有至少約50% (例如，至少約55%、60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)的同一性的氨基酸序列 的甲酰甘氨酸產生酶（FGE)蛋白，其中第一和/或第二核酸是外源性的，并且其中一旦在 細胞培養條件下培養后，細胞產生包含至少約50% (例如，至少約55%、60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)的對應于5￡〇10勵：1的 Cys59的半胱氨酸殘基至Ca-甲酰甘氨酸（FGly)的轉化的I2S蛋白，并且比生產率為大于 約 10 皮克 / 細胞 / 日（例如，大于約 15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、 90、95或100皮克/細胞/日）。
[0013] 在一些實施方案中，第一核酸編碼具有與SEQIDNO: 1相同的氨基酸序列的I2S 蛋白。在一些實施方案中，第二核酸編碼具有與SEQIDN0:5相同的氨基酸序列的FGE蛋 白。
[0014] 在一些實施方案中，第一和/或第二核酸可操作地連接至hCMV啟動子。
[0015] 在一些實施方案中，對第一和/或第二核酸進行密碼子優化。在一些實施方案中， 第一核酸具有與SEQIDNO: 7具有至少約50% (例如，至少約55%、60%、65%、70%、75%、 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%)的同一性的序列。在具體實施方案中，第一 核酸具有SEQIDNO:7的序列。
[0016] 在一些實施方案中，第二核酸包含與SEQIDNO:8具有至少約50% (例如，至少 約 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% )的同一性 的序列。在一些實施方案中，第二核酸具有與SEQIDN0:8相同的序列。
[0017] 在一些實施方案中，第一和第二核酸均為外源性的（也稱為重組的）。在一些實施 方案中，將第一和/或第二核酸整合（例如，穩定地）在細胞的基因組中。在一些實施方案 中，第一和/或第二核酸存在于一個或多個染色體外構建體中。
[0018] 在一些實施方案中，本發明的細胞為哺乳動物細胞。在某些實施方案中，適合的哺 乳動物細胞為人細胞。在某些實施方案中，適合的哺乳動物細胞為CH0細胞。
[0019] 在一些實施方案中，根據本發明的細胞適應于懸浮培養。在其它實施方案中，根據 本發明的細胞是貼壁的。
[0020] 在其它方面，本發明提供了通過在使得重組I2S和FGE蛋白在細胞中共表達的條 件下，培養本文中不同實施方案中描述的細胞來產生重組艾杜糖-2-硫酸酯酶（I2S)蛋白 的方法。在一些實施方案中，大規模培養細胞。在一些實施方案中，適用于本發明的大規 模為生物反應器工藝。在一些實施方案中，適用于本發明的生物反應器為選自10U200L、 500L、1000L、1500U2000L的規模。在一些實施方案中，適用于本發明的大規模（例如，生物 反應器）工藝包括灌注工藝。在一些實施方案中，適用于本發明的大規模（例如，生物反應 器）工藝包括分批培養。在一些實施方案中，適用于本發明的大規模工藝為滾瓶工藝。在 一些實施方案中，懸浮培養根據本發明的細胞。在其它實施方案中，貼壁培養根據本發明的 細胞。
[0021] 在一些實施方案中，在無血清培養基（例如，無動物、化學成分確定的或無蛋白質 的培養基）中培養根據本發明的細胞。在其它實施方案中，在含血清培養基中培養根據本 發明的細胞。
[0022] 在各個實施方案中，根據本發明的方法還包括純化重組I2S蛋白的步驟。
[0023] 在另一個方面，本發明提供了由本文中各個實施方案中描述的細胞或方法產生的 重組艾杜糖-2-硫酸酯酶（I2S)蛋白。
[0024] 在一些實施方案中，本發明提供了重組艾杜糖-2-硫酸酯酶（I2S)蛋白的制劑， 其中所述重組I2S蛋白具有與SEQIDNO:l具有至少約50% (例如，至少約55%、60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% )的同一性的氨基酸序列； 并且包含至少約 70% (例如，至少約 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、 100% )的對應于SEQIDNO: 1的Cys59的半胱氨酸殘基至Ca-甲酰甘氨酸（FGly)的轉 化。在一些實施方案中，重組I2S蛋白具有與SEQIDNO: 1相同的氨基酸序列。在一些實 施方案中，重組I2S蛋白具有至少約 20U/mg、30U/mg、40U/mg、50U/mg、60U/mg、70U/mg、80U/ mg、90U/mg或100U/mg的比活性，如使用肝素二糖作為底物通過體外硫酸醋釋放活性測定 所測定的。
[0025] 除其它事項以外，本發明還提供了一種包含本文中各個實施方案中描述的重組 I2S蛋白和藥學上可接受的載體的藥物組合物，以及通過向需要治療的受試者施用本文中 描述的重組I2S蛋白或包含所述重組I2S蛋白的藥物組合物來治療亨特綜合癥的方法。
[0026] 如本文中所用，除非另有明確所指，否則術語"I2S蛋白"、"I2S"、"I2S酶"或語法 等同物是指重組I2S蛋白分子的制劑。
[0027] 如本申請中所用，術語"約"和"大致"可作為等同物使用。具有或不具有約/大 致的用于本申請的任何數字旨在涵蓋由相關領域的普通技術人員所理解的任何正常波動。
[0028] 本發明的其他特征、目的和優勢在下面的詳細描述中顯而易見。然而，應當理解， 所述詳細描述，雖然表示