0個/cm2， 即C3.75~4.5)X105個cells/T75，按照4.5X10 5個cells/T75進行傳代。在培養容器上 標示細胞代數與培養時間等信息。將培養容器放置于二氧化碳恒溫恒濕培養箱開始培養。 培養條件：二氧化碳恒溫恒濕培養箱。條件：37 + 0. 5°C，二氧化碳體積分數為5 + 0. 2%。培 養至細胞融合達85 %~90 %。 陽15引經上述方法分離的細胞得率：5X IO5~IX 10 6CellsAil脂肪
[0153] 培養第7天，Pl代細胞擴增的倍數可W達到1-2倍；
[0154] 培養第14天，P2代細胞擴增的倍數可W達到4-6倍； 陽1巧]培養第21天，P3代細胞擴增的倍數可W達到10倍。 陽156] 實施例2脂肪干細胞分化的免疫染色分析（成脂誘導對照及油紅0染色實驗） 陽157] 將haMPCs W 1. 5X IO5Cells/孔的密度接種在六孔板中，W正常培養基培養的樣 本為成脂分化實驗陰性對照組。具體方法是：向基礎培養基值MEM+10%胎牛血清）中加入 1 y mol/L的地塞米松、10 y mol/L的膜島素、200 y mol/L的嗎I噪美辛和0. 5mmol/L的異下基 甲基黃嚷嶺，配制成脂誘導培養基，每周換2次液，直到進行成脂染色觀察為止，W上對照 組均做平行實驗（n = 3)。用0.5%油紅0,對成脂誘導后的各組樣本進行染色。具體操作 方法是：先用D-hanks將樣本細胞沖洗充分，然后加入油紅稀釋染色10~15min。W每組 樣本隨機選取5~10視野進行拍照觀察W考察共培養方法的成脂誘導分化效果。
[0158] 結論：該結果表明脂肪來源干細胞在成脂誘導劑作用下，脂肪間充質祖細胞能夠 生成脂質，具有分化為脂肪細胞的能力，圖1為脂肪細胞分化的油紅0染色；圖2為油紅0 染色對照組（陰性）；圖中的紅色為脂滴，可W看到成脂分化后的細胞內出現大量密集在一 起的小脂滴。
[0159] 實施例化aMPC和脂肪來源基質血管成分的流式檢測和脂肪來源基質血管成分的 表面抗原檢測
[0160] 通過酶消化法將細胞收集到離屯、管中，細胞懸液調整密度為lXl〇5cells/mL， 1，80化/min (120g)離屯、5min，棄掉上清，用4°C的冷D-Hanks沖洗重懸細胞，再次將細胞懸 液W 80化/min,離屯、5min，之后棄去上清。然后用D-化nks將細胞重懸至1血，加入抗體5~ 10 y以避光，冰上放置30min。用D-Hanks沖洗，離屯、，棄上清，重復該沖洗過程2~3次，確 保將未結合抗體除凈。最后，加入約200至300 y L的D-Hanks制成懸液，用流式細胞儀檢 。脂肪來源基質血管成分流式檢測試驗圖譜如圖4所示。 陽161] 流式結果分析
陽163] 結論：
[0164] 該結果表明：通過流式細胞儀對脂肪干細胞進行細胞表面抗原標記表達的分析， 新鮮分離的干細胞中脂肪干細胞比例為60 %，且造血干細胞含量為70 %，混合細胞較多。 [01化]I型膠原酶消化方法分離、培養的P3代細胞MSCs表面抗原流式鑒定結果： 陽 166]
陽167] 結論：
[0168] 該結果表明：通過流式細胞儀對脂肪間充質祖細胞進行細胞表面抗原標記表達的 分析該細胞純度高，大部分為脂肪間充質祖細胞，其中CD34、CD45為間充質祖細胞的陰性 標記。haMPC流式檢測試驗圖譜如圖3所示。
[0169] 細胞分泌因子的檢測
[0170] 將脂肪來源基質血管成分在特定培養室培養4她，取上清做檢測。取廝帶干細胞為 對照組。 陽 171]
[0172] W上結果說明，脂肪來源基質血管成分混合物分泌的細胞因子大于其它類型干細 胞，更有利于細胞的修復。 陽173] 實施例4脂肪來源基質血管成分與haMPC組合對乙肝的治療效果 陽174] 將收獲的haMPC與脂肪來源基質血管成分注入30ml生理鹽水，制備成細胞懸液， W備回輸使用。
[0175] 靜脈注射，細胞量> IO8個，按照SVFAaMPCs為1:1進行配比，每周注射一次，連 續四周。乙肝患者2例，分別于細胞回輸前W及回輸后的第3個月和第6個月分別進行做 臨床效果評分，評估脂肪間充質祖細胞和脂肪基質血管成分復合物治療乙肝的療效。 陽176] 抽血檢測乙肝五項，乙肝病毒DNA W及ALT.其結果如下： 陽177] 患者1 :38歲，男性，2010年8月診斷慢性乙型肝炎；肝功能異常。2011年5月接 受SVF+haMPCs細胞回輸治療，治療前后檢查指標具體如下： 陽17引
陽1巧]患者2,男性44歲，2011年2月診斷為慢性乙型肝炎。2011年9月首次接受 SVF+MPCs回輸治療，治療前后檢查指標具體如下： 陽 180]
陽181] 從W上結果看出，脂肪來源基質血管成分與haMPC的細胞混合物對于乙肝有治療 作用，可W使表面抗原下降，病毒DNA減少，并減低ALT,促進肝功能的修復。 陽182] 在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可 W對本發明作各種改動或修改，運些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范 圍。
【主權項】
1. 一種脂肪間充質祖細胞和脂肪基質血管成分組合物的用途，其特征在于，用于制備 治療乙肝的藥物組合物。2. 如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的藥物組合物包括：脂肪間充質祖細 胞、脂肪來源基質血管組分，和藥學上可接受的載體。3. 如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的治療包括選自下組的一項或多項指 標改善： 乙肝表面抗原、乙肝表面抗體、乙肝e抗原、乙肝e抗體、乙肝核心抗體、乙肝病毒DNA， 和 ALT。4. 如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的脂肪間充質祖細胞具有選自下組的 任一或多種特征： (i) 80%以上的細胞具有表面抗原CD29 ; (ii) 70%以上的細胞具有表面抗原CD73 ; (iii) 60%以上的細胞具有表面抗原CD105 ; (iv) 70%以上的細胞具有表面抗原CD90。5. 如權利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的脂肪間充質祖細胞具有選自下組 的任一或多種特征： (v) 在細胞群中，10%以下的細胞具有表面抗原CD34 ; (vi) 在細胞群中，10%以下的細胞具有表面抗原CD45。6. 如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的基質血管組分含有選自下組的細 胞因子：干細胞生長因子（HGF)，血管內皮生長因子（VEGF)、血小板衍生因子（PDGF)、 人轉化生長因子β (TGF-β)、巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF)、白介素-2(IL-2)、白介 素-10 (IL-10)、或其任意組合。7. 如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的基質血管組分具有選自下組的任一 或多種特征： (i) 20%以上的細胞具有表面抗原CD29 ; (ii) 50%以上的細胞具有表面抗原CD73 ; (iii) 80%以上的細胞具有表面抗原CD49d ; (iv) 50%以上的細胞具有表面抗原CD90 ; (v) 60%以上的細胞具有表面抗原CD34 ; (vi) 30%以上的細胞具有表面抗原HLA-DR ; (vii) 在細胞群中，10%以下的細胞具有表面抗原CD14 ; (viii) 在細胞群中，20%以下的細胞具有表面抗原CD45 ; (ix) 在細胞群中，10%以下的細胞具有表面抗原Actin。8. -種用于預防或治療肝炎的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包括：有 效量的脂肪間充質祖細胞和脂肪基質血管成分，以及藥學上可接受的載體。9. 如權利要求8所述的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物為靜脈注射試劑。10. -種用于預防或治療肝炎的藥物組合試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括：月旨 肪間充質祖細胞，脂肪基質血管成分，藥學上可接受的載體，和說明書；且所述的說明書記 載了使用方法。
【專利摘要】本發明涉及脂肪間充質祖細胞和脂肪基質血管成分組合物在預防或治療肝炎中的用途。具體地，脂肪間充質祖細胞和脂肪基質血管成分組合物可用于制備治療乙型肝炎的藥物組合物。給需要的對象施用所述的藥物組合物，可以使乙肝表面抗原、乙肝表面抗體、乙肝e抗原、乙肝e抗體、乙肝核心抗體等指標改善，并顯著減少肝炎病毒DNA，降低ALT，從而促進肝功能的修復。
【IPC分類】A61K35/35, A61P1/16, A61K38/20, A61K38/19, A61K38/18, A61P31/20
【公開號】CN105663165
【申請號】
【發明人】曹衛, 張麗, 戴成祥, 劉佳, 蔡松柏, 鄭成小
【申請人】西比曼生物科技（上海）有限公司, 西比曼生物科技（無錫）有限公司
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2014年11月20日