所 述色譜條件如下：
[0050] 流動相C為純甲醇，流動相D為純水，柱溫30°C，檢測時間為5min，進樣量為20μ1;
[0051] 采用梯度洗脫方式，洗脫參數(shù)見表1;
[0052]表1為梯度洗脫參數(shù)
[0053]
[0054] 25羥基維生素 D3衍生物的保留時間為3.6min;[0055] 25羥基維生素 D2衍生物的保留時間為3.8min;[0056] 所述多反應(yīng)監(jiān)測MRM質(zhì)譜參數(shù)見表2，[0057]表2為質(zhì)譜參數(shù)[005P1
[005?
[0060] 所述內(nèi)標為 25-OHD3-26，26，26，27，27，27-d6。
[0061] 所述質(zhì)譜條件還包括正離子模式下，采用APCI離子源，檢測離子對m/z分別是:25_ 0HD3-PTAD 558 · 4-298 · 2、25-OHD2-PTAD 570 · 4-298 · 2、內(nèi)標564 · 4-298 · 2，離子源位置 為2.0;氣簾氣(⑶R)為10,碰撞氣(CAD)為6,離子噴霧電流(NC)為4,溫度為600 °C，離子源氣 流(GS1)為60。，所述內(nèi)標溶液濃度為50ng/ml。所述樣本前處理中的衍生包括5min渦旋處 理。所述衍生劑為4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮，濃度為200μg/ml。所述渦旋采用渦旋混 勻器。所述渦旋混勻器的轉(zhuǎn)速為2500rpm。所述血斑樣本包括干血斑標準曲線樣本、質(zhì)控干 血斑樣本和需要檢測的血斑樣本。所述干血斑標準曲線樣本的制備：取2ml處理過的全血， 分別與 4以1、1(^1、2(^1、5(^1、10(^1、20(^1濃度為叫8/1111的25-0!10混勻，即得2-100即/1111干 血斑標準曲線樣本，分別取75μ1制備好的上述樣本滴到903濾紙上晾干即得。所述質(zhì)控干血 斑樣本的制備:取2ml處理過的全血，分別與16μ1、40μ1、80μ1濃度為lμg/ml的25-OHD混勻， 即得8ng/ml (Ql)、20ng/ml (Q2)、40ng/ml (Q3)質(zhì)控干血斑樣本，分別取75μ1制備好的上述樣 本滴到903濾紙上晾干即得。所述處理過的全血通過將全血離心，去除上層血漿，將血細胞 用0.9 %生理鹽水洗滌3次后，與生理鹽水1:1混勻即得。
[0062] 干血片樣品中25羥基維生素 D的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測的試劑盒，所述試劑盒包 含以下組分：
[0063] (1)洗脫液：
[0064] 洗脫液C:甲醇，純度為100%;
[0065]洗脫液D:純水；
[0066] (2)標準曲線干血片樣品：含25羥基維生素 D2，25羥基維生素 D3的干血片，濃度為 0-100ng/ml；
[0067] (3)內(nèi)標溶液:含有d6-25羥基維生素 D3的甲醇溶液；
[0068] (4)萃取劑:丙酮，純度為100%;
[0069] (5)衍生液:200μg/ml的4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD);
[0070] (6)終止液：乙醇，純度為100%;
[0071] (7)復溶液:80%的甲醇；
[0072] (8)質(zhì)控品干血片樣品：含有25羥基維生素 D2,25羥基維生素 D3的干血片樣品，濃 度分別為QC1: 8ng/ml; QC2:20ng/ml; QC3:40ng/ml;
[0073]所述試劑盒的組分如下表：
[0074]
[0075] 具體實施例
[0076] 1、全血基質(zhì)制備
[0077] 將全血離心，去除上層血漿，留血細胞待用。將血細胞用0.9%生理鹽水洗滌3次 后，與生理鹽水1:1混勻即得處理過的全血。
[0078] 干血斑標準曲線樣本及質(zhì)控干血斑樣本(QC血片）制備
[0079] 所述干血斑標準曲線樣本的制備:取2ml處理過的全血，分別與4μ1、?ομL、20μ1、50 μL、100μΙ、200μ1濃度為lμg/ml的25-OHD混勻，即得2-100ng/ml干血斑標準曲線樣本，分別 取75μ1制備好的上述樣本滴到903濾紙上晾干即得。
[0080] 所述質(zhì)控干血斑樣本的制備:取2ml處理過的全血，分別與16μ1、40μ1、80μ1濃度為 lμg/ml的25-OHD混勾，即得8ng/ml(Ql)、20ng/ml(Q2)、40ng/ml(Q3)質(zhì)控干血斑樣本，分別 取75μ1制備好的上述樣本滴到903濾紙上晾干即得。以、〇2、〇3，是三個濃度不同的質(zhì)控品， 分別是低、中、高濃度的質(zhì)控品。
[0081 ] 2、樣本前處理
[0082] 萃取：用3/16打孔器打一個血斑樣本到含內(nèi)標溶液（10yl，50ng/ml)的2ml離心管 中，加入500μ1丙酮，超聲提取30min后，以轉(zhuǎn)速2500rpm在渦旋混勻器中渦旋30min。將提取 液轉(zhuǎn)移到2ml離心管中，60°C吹干。
[0083] 衍生:將100μΙ衍生劑加入到吹干后的殘渣中，室溫下反應(yīng)lh(含5min渦旋）后，加 入80μ1乙醇，渦旋5min，60°C吹干。
[0084] 復溶：50μ1 80%甲醇復溶，以轉(zhuǎn)速2500rpm在渦旋混勻器中渦旋5min，以轉(zhuǎn)速 13000rpm離心3min，取上層清液轉(zhuǎn)移到內(nèi)插管中，進樣分析。
[0085] 3、色譜條件
[0086] 流動相:C相為純甲醇一D相為純水，柱溫30°C，檢測時間5min，進樣量20μ1。
[0087]表1洗脫梯度
[0088]
[0089] 4、質(zhì)譜條件
[0090] 正離子模式下，采用APCI離子源，MRM檢測方式檢測，檢測離子對(m/z)分別是:25_ 0HD3-PTAD 558 · 4-298 · 2、25-OHD2-PTAD 570 · 4-298 · 2、內(nèi)標564 · 4-298 · 2，離子源位置 為2.0。氣簾氣(⑶R)為10,碰撞氣(CAD)為6,離子噴霧電流(NC)為4,溫度為600 °C，離子源氣 流(GS1)為60。聚焦電勢(DP)、入口電勢(EP)、碰撞能量(CE)、碰撞室出口（CXP)電勢見表2。
[0091] 表2質(zhì)譜相關(guān)參數(shù)設(shè)置
[0092]
[0093] 以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實施方式】，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換， 都應(yīng)該涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書的保護 范圍為準。
【主權(quán)項】
1. 干血片樣品中25?基維生素 D的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，其特征在于，包括如下 步驟： (1) 樣本前處理:用3/16打孔器打一個血斑樣本到含內(nèi)標溶液10山的第一離屯、管中，加 入50化1丙酬，超聲提取30min后，滿旋30min得到提取液;將提取液轉(zhuǎn)移到第二離屯、管中，60 °C吹干； 衍生:將10化1衍生劑加入到吹干后的殘渣中，室溫下反應(yīng)1小時后加入SOiil乙醇，滿旋 5min，60°C 吹干； 復溶:將50iil 80%甲醇加入衍生吹干后的殘渣中進行復溶，滿旋5min，W1300化pm的 轉(zhuǎn)速離屯、3min，取上層清液轉(zhuǎn)移到內(nèi)插管中，進樣分析； (2) 采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測經(jīng)上述處理的干血片樣品中25徑基維生素 D， 其中采用的是多反應(yīng)監(jiān)測MRM掃描方式，所述色譜條件如下： 流動相C為純甲醇，流動相D為純水，柱溫30°C，檢測時間為5min，進樣量為20山； 采用梯度洗脫方式，洗脫參數(shù)見表1; 表1為梯度洗脫參數(shù)25徑基維生素 D3衍生物的保留時間為3.6min; 25徑基維生素 D2衍生物的保留時間為3. Smin; 所述多反應(yīng)監(jiān)測MRM質(zhì)譜參數(shù)見表2， 表2為質(zhì)譜參數(shù)2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述質(zhì)譜條件還包括正離子模式下，采用 APCI離子源，檢測離子對m/z分別是：25-OHD3-PTAD 558.4一298.2、25-OHD2-PTAD 570.4一 298.2、內(nèi)標564.4一298.2,離子源位置為2.0;氣簾氣(CUR)為10,碰撞氣(CAD)為6,離子噴 霧電流(NC)為4,溫度為600°C，離子源氣流(GSl)為60。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述內(nèi)標溶液濃度為50ng/ml。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述衍生劑為4-苯基-1，2，4-S挫嘟-3，5-二酬，濃度為20化g/ml。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述滿旋采用滿旋混勻器。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述滿旋混勻器的轉(zhuǎn)速為2500rpm。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述血斑樣本包括干血斑標準曲線樣本、 質(zhì)控干血斑樣本和需要檢測的血斑樣本。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述干血斑標準曲線樣本的制備:取2ml處 理過的全血，分別與鈕1、IOiil、20iil、50iU、IOOiil、200iU濃度為化g/ml的25-0皿混勻，即得 2-lOOng/ml干血斑標準曲線樣本，分別取75iil制備好的上述樣本滴到903濾紙上驚干即得。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述質(zhì)控干血斑樣本的制備:取2ml處理過 的全血，分別與1641、4化1、8041濃度為化旨/1111的25-0皿混勻，即得加旨/1111(91)、20叫/1111 (Q2)、40ng/ml(Q3)質(zhì)控干血斑樣本，分別取75iU制備好的上述樣本滴到903濾紙上驚干即 得； 所述處理過的全血通過將全血離屯、，去除上層血漿，將血細胞用0.9%生理鹽水洗涂3 次后，與生理鹽水1:1混勻即得。10. 干血片樣品中25徑基維生素 D的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測的試劑盒，其特征在于，所 述試劑盒包含W下溶液： (1) 洗脫液： 洗脫液C:甲醇，純度為100%; 洗脫液D:純水； (2) 標準曲線干血片樣品：含25徑基維生素02,25徑基維生素 D3的干血片，濃度為0-lOOng/ml； (3) 內(nèi)標溶液:含有(16-25?基維生素 D3的甲醇溶液； (4) 萃取劑:丙酬，純度為100 %; (5) 衍生液:200μg/ml的4-苯基-1，2，4-S挫嘟-3，5-二酬(PTAD); (6) 終止液：乙醇，純度為100 % ; (7) 復溶液:80%的甲醇； (8) 質(zhì)控品干血片樣品：含有25徑基維生素02,25徑基維生素 D3的干血片樣品，濃度分 別為QCl: 8ng/ml; QC2:20ng/ml; QC3:40ng/ml。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種干血片樣品中25羥基維生素D的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，其前處理工藝，主要包括樣本前處理、衍生、復溶工序，同時采用多反應(yīng)監(jiān)測MRM掃描方式，該方法實現(xiàn)干血片中25羥基維生素D的高通量液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測，解決傳統(tǒng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法樣本量需求量量大、采樣、運輸不方便的問題，通過對檢測技術(shù)的改進，實現(xiàn)干血片中25羥基維生素D的檢測，檢測者可在家自行采集，樣本需求量減小，采樣、運輸方便。
【IPC分類】G01N30/06, G01N30/02
【公開號】CN105651901
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】何健, 郭玉梅, 宋曉濤
【申請人】北京洛奇臨床檢驗所股份有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年4月11日