干血片樣品中25羥基維生素d的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及25羥基維生素 D檢測(cè)的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種改良的液相色譜串聯(lián) 質(zhì)譜法檢測(cè)25羥基維生素 D。
【背景技術(shù)】
[0002] 近十年來，大量研究顯示維生素 D在健康和疾病中發(fā)揮重要作用（Ho lick MF.Deficiency of sunlight and vitamin D.BMJ 2008；336:1318-9.Holick MF,Chen TC.Vitamin D deficiency:a worldwide problem with health consequences.Am J Clin Nutr 2008;87:10803-63.)。維生素0不僅與佝僂病、骨質(zhì)疏松等密切相關(guān)，與癌癥、高 血壓、糖尿病、多發(fā)性硬化癥、抑郁等也存在關(guān)系（Holick MF.Vitamin D deficiency.N Engl J Med 2007;357:266-81.)。研究顯示幼年時(shí)期維生素 D水平與童年晚期或者成年時(shí) 期的許多紊亂疾病存在聯(lián)系（McGrath J.Does'imprinting'with low prenatal vitamin D contribute to the risk of various adult disorders?Med Hypotheses 2001;56: 367-71.)，例如研究顯示，胎兒期低維生素 D水平不僅與新生兒股骨長(zhǎng)度有關(guān)(Morley R， Carlin JB,Pasco JA,ffark JD.Maternal 25-hydroxyvitamin D and parathyroid hormone concentrations and offspring birth size.J Clin Endocrinol Metab 2006； 91:906-12·)，還會(huì)在 9 歲時(shí)降低骨密度（Javaid MK,Crozier SR, Harvey NC,et al.Maternal vitamin D status during pregnancy and childhood bone mass at age 9years: a longitudinal study .Lancet 2006; 367:36-43 .)。鑒于維生素 D 水平與健康息息 相關(guān)，其水平的評(píng)估也越來越引起關(guān)注。25羥基維生素 D是維生素 D的穩(wěn)定代謝物，能夠準(zhǔn)確 評(píng)估維生素 D的水平。傳統(tǒng)的維生素 D檢測(cè)方法是一些放射免疫的方法，由于存在蛋白交叉 反應(yīng)，定量不準(zhǔn)確。有文獻(xiàn)報(bào)道維生素 D2和D3這兩種形式的維生素 D在生物活性和生物利用 率上可能具有差異(Armas etc，（ 2004) J · Cl in · Endocrinol · Metab · 89:5387-5391 )，而傳統(tǒng) 的免疫方法不能區(qū)分維生素 D2和D3?，F(xiàn)在越來越多的維生素 D檢測(cè)采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜 (LC-MS/MS)的方法，該方法可以同時(shí)定量25羥基維生素 D2和25羥基維生素 D3,評(píng)估體內(nèi)維 生素 D2 和 D3 的水平（Asuka Mochizukl，Yoshio Kodera，Tatsuya Saito，et al .Preanalytical evaluation of serum 25-hydroxyvitamin D3and 25-hydroxyvitamin D2measurements using LC-MS/MS. Cl inica Chimica Acta 420(2013) 114-120)，并且方法專屬性和靈敏度性高。傳統(tǒng)的25羥基維生素 D檢測(cè)方法有放射免疫法、 競(jìng)爭(zhēng)蛋白結(jié)合法、高效液相色譜法等，但是主要存在如下問題:第一、由于25羥基維生素 D在 人體內(nèi)主要與血清結(jié)合蛋白DBP結(jié)合，且人體內(nèi)存在大量的高親和力結(jié)合蛋白，因此檢測(cè)存 在嚴(yán)重的基質(zhì)干擾。而傳統(tǒng)的放射免疫法和競(jìng)爭(zhēng)蛋白結(jié)合法，不能有效祛除基質(zhì)干擾;第 二，現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)，前處理復(fù)雜、分析時(shí)間長(zhǎng)，方法特異性差;第三，不能同時(shí)準(zhǔn)確定量25羥 基維生素 D2和25羥基維生素 D3的含量，無法給出準(zhǔn)確的25羥基維生素 D的含量;第四，整個(gè) 檢測(cè)過程時(shí)間長(zhǎng)、通量低。本發(fā)明對(duì)25羥基維生素 D檢測(cè)方法進(jìn)行改良，前處理更加簡(jiǎn)單、方 便，僅僅需要一步溶劑處理過程，達(dá)到蛋白沉淀和樣本萃取雙重效果，時(shí)間大大縮短。衍生 步驟，顯著的提高了樣本檢測(cè)的靈敏度，可以將傳統(tǒng)方法幾百微升的樣本量減少到幾微升。
[0003] 本申請(qǐng)檢測(cè)的樣本是干血片樣本，可以居家采樣，不用專業(yè)人員采樣，樣本量少， 常溫保存和運(yùn)輸。不像常規(guī)的VD檢測(cè)，需要到醫(yī)療機(jī)構(gòu)，有專業(yè)人員采樣，而且樣本量大，樣 本需要專業(yè)人員離心處理，并冷凍保存和運(yùn)輸。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有25羥基維生素 D檢測(cè)方法技術(shù)中存在的部分問題，提供 一種干血片樣品中25羥基維生素 D的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法及試劑盒。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0006] -種干血片樣品中25羥基維生素 D的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，包括如下步驟：
[0007] (1)樣本前處理：用3/16打孔器打一個(gè)血斑樣本到含內(nèi)標(biāo)溶液10μ1的第一離心管 中，加入500μ1丙酮，超聲提取30min后，2500rpm渦旋30min;將提取液轉(zhuǎn)移到第二離心管中， 60°C吹干；
[0008] 衍生:將100μΙ衍生劑加入到吹干后的殘?jiān)?，室溫下反?yīng)lh后加入80μ1乙醇，渦 旋 5min，60°C 吹干；
[0009] 復(fù)溶：將50μ1 80 %甲醇加入衍生吹干后的殘?jiān)羞M(jìn)行復(fù)溶，渦旋5min，13000rpm 離心3min，取上層清液轉(zhuǎn)移到內(nèi)插管中，進(jìn)樣分析；
[0010] (2)檢測(cè)方法為液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，其中采用的是多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM掃描方式，所 述色譜條件如下：
[0011] 流動(dòng)相C為純甲醇，流動(dòng)相D為純水，柱溫30°C，檢測(cè)時(shí)間為5min，進(jìn)樣量為20μ1;
[0012] 采用梯度洗脫方式，洗脫參數(shù)見表1;
[0013] 表1為梯度洗脫參數(shù)
[0014]
[0015] 25羥基維生素 D3衍生物的保留時(shí)間為3.6min;
[0016] 25羥基維生素 D2衍生物的保留時(shí)間為3.8min;
[0017] 所述多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM質(zhì)譜參數(shù)見表2，
[0018] 表2為質(zhì)譜參數(shù) [00191
[0020] 優(yōu)選地，所述質(zhì)譜條件還包括正離子模式下，采用APCI離子源，檢測(cè)離子對(duì)m/z分 別是：25-OHD3-PTAD 558 · 4-298 · 2、25-OHD2-PTAD 570 · 4-298 · 2、內(nèi)標(biāo)564 · 4-298 · 2，離 子源位置為2.0;氣簾氣(⑶R)為10,碰撞氣(CAD)為6,離子噴霧電流(NC)為4,溫度為600 °C， 離子源氣流(GS1)為60。
[0021]優(yōu)選地，所述內(nèi)標(biāo)溶液濃度為50ng/ml。
[0022] 優(yōu)選地，所述衍生劑為4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮，濃度為200μg/ml。
[0023] 優(yōu)選地，所述渦旋采用渦旋混勻器。
[0024] 優(yōu)選地，所述渦旋混勻器的轉(zhuǎn)速為2500rpm。
[0025] 優(yōu)選地，所述血斑樣本包括干血斑標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本、質(zhì)控干血斑樣本和需要檢測(cè)的 血斑樣本。
[0026] 優(yōu)選地，所述干血斑標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本的制備:取2ml處理過的全血，分別與4μ1、10μ1、 20μ1、50μ1、100μΙ、200μ1濃度為lμg/ml的25-OHD混勻，即得2-100ng/ml干血斑標(biāo)準(zhǔn)曲線樣 本，分別取75μ1制備好的上述樣本滴到903濾紙上晾干即得。
[0027] 優(yōu)選地，所述質(zhì)控干血斑樣本的制備:取2ml處理過的全血，分別與16μ1、40μ1、80μ 1 濃度為lμg/ml 的25-OHD混勾，即得8ng/ml(Ql)、20ng/ml (Q2)、40ng/ml(Q3)質(zhì)控干血斑樣 本，分別取75μ1制備好的上述樣本滴到903濾紙上晾干即得。
[0028] 優(yōu)選地，所述處理過的全血通過將全血離心，去除上層血漿，將血細(xì)胞用0.9%生 理鹽水洗滌3次后，與生理鹽水1:1混勻即得。
[0029] 本發(fā)明的另一方面是通過以下方案實(shí)現(xiàn)的：
[0030] 干血片樣品中25羥基維生素 D的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包 含以下溶液：
[0031] (1)洗脫液：
[0032] 洗脫液C:甲醇，純度為100%;
[0033]洗脫液D:純水；
[0034] (2)標(biāo)準(zhǔn)曲線干血片樣品：含25羥基維生素 D2，25羥基維生素 D3的干血片，濃度為 0-100ng/ml；
[0035] (3)內(nèi)標(biāo)溶液:含有d6-25羥基維生素 D3的甲醇溶液；
[0036] (4)萃取劑:丙酮，純度為100%;
[0037] (5)衍生液：200μg/ml的4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD);
[0038] (6)終止液：乙醇，純度為100%;
[0039] (7)復(fù)溶液:80%的甲醇；
[0040] (8)質(zhì)控品干血片樣品：含有25羥基維生素 D2,25羥基維生素 D3的干血片樣品，濃 度分別為QC1: 8ng/ml; QC2:20ng/ml; QC3:40ng/ml。
[0041]本發(fā)明的有益效果:通過對(duì)前處理方法的改良，前處理更加簡(jiǎn)單、快捷，可實(shí)現(xiàn)批 量處理；同時(shí)APCI為大氣壓力化學(xué)電離源，樣品先形成霧，然后電暈放電針對(duì)其放電，在高 壓電弧中，樣品被電離，然后去溶劑化形成離子，最后檢測(cè)，對(duì)極性小的樣品效果較好，大大 提高了檢測(cè)信號(hào)的靈敏度;方法學(xué)考察結(jié)果顯示，該方法精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性均滿足定 量分析要求;柱溫為30°C，接近于常溫，有利于被檢測(cè)化合物的穩(wěn)定，申請(qǐng)人檢測(cè)的化合物 已經(jīng)是經(jīng)過衍生后的，這個(gè)溫度能減少降解，提高檢測(cè)準(zhǔn)確度。
【附圖說明】
[0042]圖1:標(biāo)準(zhǔn)品中25羥基維生素 D3、D2及內(nèi)標(biāo)衍生化后總離子流色譜圖；
[0043]圖2:干血片樣品中25羥基維生素 D3、D2及內(nèi)標(biāo)衍生化后總離子流色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0044] 為了更好地說明本發(fā)明，下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描 述。
[0045] -種干血片樣品中25羥基維生素 D的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，包括如下步驟：
[0046] (1)樣本前處理：用3/16打孔器打一個(gè)血斑樣本到含內(nèi)標(biāo)溶液10μ1的第一離心管 中，加入500μ1丙酮，超聲提取30min后，以轉(zhuǎn)速2500rpm渦旋30min;將提取液轉(zhuǎn)移到第二離 心管中，60 °C吹干；
[0047] 衍生:將100μΙ衍生劑加入到吹干后的殘?jiān)?，室溫下反?yīng)lh后加入80μ1乙醇，渦 旋 5min，60°C 吹干；
[0048] 復(fù)溶：將50μ1 80 %甲醇加入衍生吹干后的殘?jiān)羞M(jìn)行復(fù)溶，渦旋5min，13000rpm 離心3min，取上層清液轉(zhuǎn)移到內(nèi)插管中，進(jìn)樣分析；
[0049] (2)檢測(cè)方法為液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，其中采用的是多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM掃描方式，