對治療性化合物敏感性降低的乙型肝炎變異株、變異株的檢測及其用圖
【專利說明】對治療性化合物敏感性降低的乙型肝炎變異株、變異株的檢測及其用途
[0001 ] 本申請是分案申請，原申請的申請日為2009年4月3日，申請號為200980113181.6(PCT/CN2009/000364)，發明名稱為“對治療性化合物敏感性降低的乙型肝炎變異株、變異株的檢測及其用途”。
[0002]相關申請的交叉引用
[0003]本申請要求保護2008年4月5日提交的美國臨時申請順序號61/042,721的權益，該申請通過引用其整體結合到本文中。
[0004]發明背景
[0005]乙型肝炎病毒(HBV)感染是影響世界范圍大約20億人口的嚴重的全球性健康問題。大約4億受HBV感染的人是長期攜帶者。每年約I百萬人死于各種HBV疾病，例如慢性肝炎、肝硬化和肝細胞癌(HCC)(世界衛生組織(World Health Organizat1n) ,2000)。這種疾病在西方國家相對較少，主要在成人期得病。然而，該疾病在亞洲和非洲國家實際上是流行病，其中大多數慢性HBV感染是在圍產期或兒童期獲得的。
[0006]乙型肝炎病毒(HBV)是一種約3200個堿基的小DNA病毒，具有廣泛的序列變異性。目前已確定的有8種基因型(A?H)。
[0007]這種病毒可引起虛弱性疾病癥狀。急性感染可能導致肝衰竭，但這種情況極少見。在出生時或在嬰兒期受到感染的人，90%以上的乙型肝炎感染會發展成慢性形式。在25-40 %患者中，慢性感染最終導致肝硬化和肝癌。據估計，HBV引起全球30 %的肝硬化和50 %的HCCXPerz等，2006)。這個沉重的負擔使得開發有效用于降低HCC風險的抗病毒療法的需求變得十分突出(Liaw等，2004)。監測患者對這類療法的反應也因此十分重要。
[0008]HBV主要是垂直傳播，病毒由受感染的母親傳給出生時的嬰兒。嬰兒也可通過與受感染的父母和兄弟姐妹緊密接觸而被感染。HBV也可通過性接觸或與受感染血液接觸而水平傳播。
[0009]該病毒通過RNA中間體復制，并利用在其復制策略中缺乏校正能力的反轉錄。HBV基因組部分是雙鏈，在4個重疊可讀框中編碼包膜、前核心(precore)/核心、反轉錄酶/聚合酶和X基因。
[0010]包膜蛋白抗原稱為HBsAg(乙型肝炎表面抗原)，它構成病毒的外表層。核心蛋白抗原稱為HBcAg(乙型肝炎核心抗原)，它構成包裹HBV DNA的病毒核心。前核心蛋白抗原稱為HBeAg(乙型肝炎e抗原)，其功能不詳。X蛋白抗原稱為HBxAg(乙型肝炎X抗原)，其確切功能也不詳。
[0011]聚合酶基因與包膜基因重疊。因此，影響聚合酶基因的催化結構域的突變也可影響包膜蛋白的蛋白質序列，反之亦然。
[0012]慢性乙型肝炎感染的現行治療包括干擾素和核苷/核苷酸類似物。遺憾的是，用干擾素治療有許多副作用，且只有少數患者對治療起反應。
[0013]核苷或核苷酸類似物是經化學方法改造的核苷酸，被開發用作在病毒復制期間抑制病毒DNA合成的取代結構單元。目前已獲準(在美國)用于慢性乙型肝炎治療的核苷和核苷酸類似物為:拉米夫定(Iamivudine) (3TC或LMV)、替比夫定(telbivudine) (L-dT)、恩替卡韋(entecavir) (ETV)、阿德福韋(adefovir) (ADV)和替諾福韋(tenofovir)。
[0014]雖然這些化合物在抑制HBV DNA合成方面已見成效，但是它們需要長期治療，而且在長期治療中，存在出現抗藥性突變型HBV毒株的可能。在用LMV長期治療的患者中，賦以普遍抗藥性的突變為rtM204I/V+/-rtL180M(Allen等，1998)以及其它突變。在一些患者中，在長期治療時出現在HBV DNA聚合酶基因的B、C和D結構域上攜帶突變的抗藥性病毒毒株。因此與LMV治療而無抗藥性病毒的患者相比，這些患者具有較高的發生HCC的風險。
[0015]另外，在乙型肝炎e抗原(HBeAg)血清轉化的過程中，因免疫壓力下的選擇所致出現前核心和核心啟動子突變體。這些前核心突變體意味著會引起更嚴重的HBV感染。核心啟動子突變體，在引起前核心mRNA轉錄和HBeAg產生降低的同時提高病毒復制，同樣與HCC的發生有關。
[0016]Kazim等人(2006)報道了核心啟動子和YMDD基序突變與在進行長期LMV療法的患者中的病毒突破(viral breakthrough)有關。同樣，在接種HBV疫苗的兒童中，在肝移植后接受抗HBV免疫球蛋白療法的患者中，在具有隱伏感染的患者中(Weber，2005)以及在用LMV治療的患者中(Torresi等，2002)，發現了編碼表面抗原的基因變異體。
[0017]HBV疫苗的保護是基于針對HBV表面抗原(HBsAg)的主要抗原表位的抗體的誘導。對于患有乙型肝炎相關的末期肝病并已進行肝移植的患者，通過給予從已接種疫苗的受治療者中得到的乙型肝炎免疫球蛋白，來針對復發性HBV感染提供預防。此外，免疫逃逸HBV突變體的出現即使在有足夠抗體效價的情況下也導致病毒持續感染。
[0018]因此，開發有效的抗病毒療法需要用于監測抗藥性HBV毒株出現的方法以及開發檢測和鑒定這些抗藥性病毒的測定法，以使得臨床醫生可以在出現抗藥性時及時改用不同的治療方案。
[0019]多項研究指出全球不同基因型的發生率(Lindh，M，Anderson AS,GusdalA.Genotypes ?nt 1858variants ?and geographic origin of hepatitis B virus—large-scale analysis using a new genotyping method(乙型肝炎病毒的基因型、nt1858變異株和地理起源--采用新的基因型分型方法進行大規模分析).J Infect Dis1997；175:1285-1293；Chan HLY，Tsui SKff?Tse C_H，Ng EYT，Au TCC，Yuen L，Bartholomeusz A?Leung K_S，Lee K_H，Locarnini S?Sung JJY.Epidem1logical andvirological characteristics of 2subgroups ofhepatitis B virus genotype C(乙型肝炎病毒C基因型2亞型的流行病學和病毒學特征).J Infect Dis 2005；191:2022-2032；以及Yuen M-F?Sablon E,Yuan H_J，Wong DK-H?Hui C_K，Wong BC-Y?Chan AO-O?LaiCL.Signif icance of hepatitis B genotype in acute exacerbat1n，HBeAgseroconvers1n?cirrhosis-related complicat1ns，and hepatocellular carcinoma(乙型肝炎基因型在急性加重、HBeAg血清轉化、肝硬化相關并發癥和肝細胞癌中的重要性).Hepatology 2003; 37:562-567)以及不同基因型對疾病并發癥(例如肝硬化、HCC的發生)的誘因(Kuang SY，Jackson PE，Wang J-B?Lu P-X?Munoz A，Qian G_S，Kensler Tff ?Groopman JD.Specific mutat1ns of hepatitis B virus in plasma predict livercancer development(血楽中乙型肝炎病毒的特定突變預示肝癌的發生).Proc Natl AcadSciiUSA 2004;101:3575-3580;以及Yuen MF?Sablon E?Wong DKH?Yuan H-J?Wong BC-Y?Chan AOO，Lai CL.Role of hepatitis B virus genotypes in chronic hepatitis Bexacerbat1n(乙型肝炎病毒基因型在慢性乙型肝炎惡化中的作用).Clin Infect Dis2003;37:593-597)以及對治療的反應(Kao JH,Chen PJ,Lai MY,Chen DS.Hepatitis Bgenotypes correlate with clinical outcomes in patients with chronic hepatitisB(乙型肝炎基因型與慢性乙型肝炎患者的臨床結果相關聯).Gastroenterology 2000 ；118:554-559; 118:554-559;以及Buti M,Cotrina M,Valdes A, Jardi R,Rodriguez-FriasF,Esteban R.1s hepatitis B virus subtype testing useful in predictingvirological response and resistance to lamivudine(乙型肝炎病毒亞型測定可用于預測病毒學應答和拉米夫定抗藥性嗎)？j Hepatol 2002;36:445-446)。
[0020]為了輔助治療乙型肝炎患者，開發了基于反向斑點印跡(RDB)等位基因特異性寡核苷酸(ASO)雜交技術的各種測試條(test trip)以鑒定基因型(INNO-LiPA HBV基因型分型，Innogenetics NV，Belgium)或突變(INNO-LiPA HBV前核心，Innogenetics NV,Belgium；以及INNO-LiPA DR，Innogenetics NV,Belgium)。因為對于在分析過程中的所有變異株，RDB-ASO原理需要相同的雜交和洗滌條件，所以所有正常和突變體探針可能需要相似的解鏈溫度(Tm) (Saiki RK,Walsh PS,Levenson CH,Erlich HA.Genetic analysis ofamplified DNA with an immobilised sequence-specific oligonucleotide probe(用固定化序列特異性寡核苷酸探針進行的擴增DNA的遺傳學分析).Proc Natl Acad Sci ,USA.1989 ;86:6230-6234)。這就給在一個RDB條帶上測試>20個突變/基因型提出了限制。目前需要3個單獨的測試條來評價8種基因型和12個突變(INNO-LiPA HBV基因型分型，Innogenetics NV,Belgium； INNO-LiPA HBV前核心，Innogenetics NV，Belgium;以及INNO-LiPA DR，Innogenetics NV，Belgium)。其他研究小組設計了寡核苷酸微陣列/芯片，但均應用相同的 RDB-ASO 原理(H，Cho M,Hco J，Kim H, Jun H,Shin W，Cho B，Park H，KimC.01igonucleotide chip for detect1n of lamivudine—resistant Hepatitis BVirus(用于檢測拉米夫定抗性乙型肝炎病毒的寡核苷酸芯片).J Clin Microb1l 2004；42:4181