6 所示），該序列編碼 SEQ ID N0 :23 和 SEQ ID N0 :24 所示 的Epac蛋白。轉化
[0173] 將重組質粒pRSETb-wtEpac轉入大腸桿菌E. coil Machl感受態細胞中，具體方法 如下：
[0174] (1)在超凈工作臺內取適量連接產物或質粒加到已分裝的感受態細胞內，冰浴 30min ；
[0175] (2)于42°C水浴熱激90s后迅速冰浴3~5min ;
[0176] (3)向上述各管中加500 μ L LB培養基進行復蘇，于37 °C振蕩培養lh ;
[0177] (4)取適量菌液均勻涂布至LB平板（相應抗性），于37°C培養箱倒置過夜培養；
[0178] (5)次日可取出平板觀察菌落牛長情況，講行之后的陽性克降篩詵工作。
[0179] 實施例 2 pRSETb-Epac2B-cpYFP 和 pRSETb-Epacl-cpYFP 的構建和表達
[0180] 探針構建原理：
[0181] 通過對Epac2B_CNBD晶體結構及與cAMP結合的關鍵區域結構進行分析，初步設計 4 種 cpYFP 插入位點，分別為 P/D (23/24)、H/L (58/59)、N/T (162/163)、Q/D (171/172)，其中 23/24靠近本binding-domain的N端，58/59位于cAMP結合的疏水口袋區域，162/163位 于cAMP結合性保守區域與Epac特征性VLVLE保守序列的柔性鉸鏈處，而171/172則緊靠 VLVLE保守序列，所選該幾種位點均位于Epac2B在結合cAMP前后構象會發生顯著變化的區 域。
[0182] 通過對Epac 1的晶體結構以及Epac2B的4個插入位點分析后我們選擇了 K/ T (162/163)這一個位點來進行cpYFP的插入。162/163位點是根據Epac2B-cpYFP四種基 礎模型的檢測結果，選擇其中響應較為理想的一種插入位點N/T (162/163)作為參照對象 而設計的。
[0183] 引物設計如下：
[0184]
[0186] 1.擴增cpYFP的核酸序列：
[0187] 以 MD9-cpYFP(Nagai，Τ·等，Proc Natl Acad Sci U S A. 2001，V. 98(6)， pp. 3197-3202)為模板，利用引物cpYFP-F及cpYFP-R擴增黃色熒光蛋白cpYFP的編碼序 列。
[0188] 目的片段擴增：
[0189]
[0190]
[0191] cpYFP目的基因片段回收及純化具體操作參考膠回收試劑盒（BBI公司）說明書。
[0192] 2.目的片段與載體相連接
[0193] 將回收后的cpYFP片段及不同位點的載體質粒pRSTb_Epac2B分別進行雙酶切，體 系如下：
[0194]
[0195] 于37°C電熱恒溫隔水式培養箱內孵育3~5h或過夜（根據所用內切酶的效率特 性決定），結束后可將樣品暫存于_20°C待用。
[0196] 將回收后的cpYFP片段及不同的載體質粒pRSTb-Epac雙酶切片段分別連接，體系 如下：
[0197]
[0198]
[0199] 于16°C低溫恒溫金屬浴中孵育3~5h或于22°C孵育1~2h，結束后可將樣品暫 存于-20 °C待用。
[0200] 篩選陽性克隆送取菌液測序，由北京華大基因公司上海部完成。測序結果用 Vector NTI 8.0進行比對分析。結果表明各質粒中確實插入了 cpYFP的核苷酸序列（如 SEQ ID N0:22 所示），Epac2B-cpYFP 4 個探針為編碼 SEQ ID 勵：39、40、41、42所示的蛋 白，Epacl-cpYFP探針為編碼SEQ ID N0 :67所示的蛋白。
[0201] 3.轉化
[0202] 將重組質粒pRSETb-Epac2B-cpYFP轉入大腸桿菌E. coil BL21-plys感受態細胞 中，具體方法如下：
[0203] (1)在超凈工作臺內取適量連接產物或質粒加到已分裝的感受態細胞內，冰浴 30min ；
[0204] (2)于42°C水浴熱激90s后迅速冰浴3~5min ;
[0205] (3)向上述各管中加500 μ L LB培養基進行復蘇，于37 °C振蕩培養lh ;
[0206] (4)取適量菌液均勻涂布至LB平板（相應抗性），于37°C培養箱倒置過夜培養；
[0207] (5)次日可取出平板觀察菌落生長情況，進行之后的陽性克隆篩選工作。
[0208] 挑取陽性克隆菌落至配有新鮮培養基（含相應抗生素）的試管內，37°C搖床培養 過夜。培養至0D值為0. 6時向已生長至最佳狀態的菌液中加入0.1 mM IPTG誘導劑，于18°C 搖床培養20h，用鎳離子親和層析柱從裂解菌液中分離并純化幾種Epac2B-cpYFP蛋白。
[0209] 實施例 3 Epac2B-N162/T163-cpYFP 和 Epacl-K162/T163-cpYFP 衍生系列探針
[0210] 探針構建原理：
[0211] 由于不確定在Epac-cpYFP基本模型中cpYFP熒光蛋白與Epac蛋白連接處氨基酸 在cAMP結合過程中具體的作用，因此本發明中利用截短突變原理進行探針的優化，通過對 連接處氨基酸分別進行正交截短來尋找變化所能達到的較佳響應變化的相對平衡位置，這 一設計對探針本身的cAMP結合常數并不會影響。
[0212] 以 Epac2B-N162/T163-cpYFP 和 Epacl-K162/T163-cpYFP 原始探針質粒為模板，參 照定點突變原理進行衍生系列探針的構建。
[0213] 1.截短突變序列設計如下：
[0214]
[0216] 2. PCR 擴增
[0217] 利用定點突變PCR進行截短突變，突變擴增條件如下：
[0218]
[0219]
[0220] 對于截短突變，首先進行單端截短體質粒的構建，然后用已單截短成功的 Epac2B-cpYFP質粒為模板，選用Epac2B NT斷開的上/下游引物和cpYFP不同截短的上/ 下游引物為來擴增其他正交截短片段。
[0221] 3. DNA片段分離、純化
[0222] (l)Dpnl 消化
[0223] 于37°C孵育上述PCR片段2~3h，利用Dpnl酶消化除去多余的模板質粒。后將 反應體系置于85°C失活20min，反應結束后樣品可用于后續分子生物學實驗。
[0224]
[0225] ⑵加磷
[0226] 于37°C孵育1~1. 5h，利用T4多聚核苷酸激酶使DNA磷酸化，以便于之后片段環 化自連，后將反應體系置于80°C失活lOmin，反應結束后樣品可用于后續分子生物學實驗。
[0227]
[0228] (3)連接
[0229] 于16°C孵育過夜，利用T4 DNA連接酶使磷酸化處理的DNA片段環化自連。
[0230]
[0231] (4)突變質粒鑒定：
[0232] 篩選陽性克隆送取菌液測序，由北京華大基因公司上海部完成。測序結果用 Vector NTI 8.0進行比對分析。
[0233] (5)構建探針系列：
[0234] 根據上述方法可獲得下述探針系列。
[0235]
[0236] 實施例4 Epac2B-N162/T163-cp3衍生系列探針
[0237] 探針構建原理：
[0238] 本發明中通過截短突變篩選首先得到一個較優探針cp3,但cp3探針在特異性方 面仍存在一定缺陷可能會限制其在活細胞內的檢測應用，因此本發明從Epac蛋白自身構 象出發，根據其結合cAMP分子后結構發生的空間構象變化，采用本領域常用的突變手段對 一系列特定序列進行定點突變修飾，通過基因序列的改變來改變所編碼的蛋白，進而影響 其結構及功能。
[0239] 利用Epac2B-N162/T163-cpYFP原始探針質粒為模板，參照定點突變原理進行衍 生系列突變體探針的構建。
[0240] 隨機突變體的構建思路與上述定點突變相似，只是在引物設計上有所差異，在設 計時需要將待突變的氨基其堿基序列設為NNN，則最終可隨機得到較多不同種類的突變體。
[0241] 1.突變序列設計如下：
[0242]
[0244] 2. PCR 擴增
[0245] 利用定點突變PCR進行定點及隨機突變，突變擴增條件如下：
[0246]
[0247]
[0248] 3.DNA片段分離、純化
[0249] (l)Dpnl 消化
[0250] 于37°C孵育上述PCR片段2~3h，利用Dpnl酶消化除去多余的模板質粒。后將 反應體系置于85°C失活20min，反應結束后樣品可用于后續分子生物學實驗。
[0251]
[0252] ⑵加磷
[0253] 于37°C孵育1~1. 5h，利用T4多聚核苷酸激酶使DNA磷酸化，以便于之后片段環 化自連，后將反應體系置于80°C失活lOmin，反應結束后樣品可用于后續分子生物學實驗。
[0254]
[0255] (3)連接
[0256] 于16°C孵育過夜，利用T4 DNA連接酶使磷酸化處理的DNA片段環化自連。
[0257]
[0258] (4)突變質粒鑒定：
[0259] 篩選陽性克隆送取菌液測序，由北京華大基因公司上海部完成。測序結果用 Vector NTI 8.0進行比對分析。
[0260] (5)構建探針系列：
[0261] 根據上述方法獲得下述探針系列。
[0262]
[0263] 實施例5環核苷酸熒光探針的光譜特性
[0264] 首先對所制備的熒光探針進行吸收光譜性質的測定，掃描300~700nm波段發現 它們在420nm和480nm處左右存在兩個顯著的吸收峰（如附圖1所示）。然后分別以420nm 激發及528nm發射為條件來進行激發、發射光譜的研究。對一系列數據進行歸一化作圖（附 圖2)，并結合本實驗室研究條件，最終確定選擇420nm和485nm為雙激發波長、528nm為發 射波長來進行不同環境下探針的熒光變化研究，同時以485nm和420nm下的熒光比值作為 cAMP響應的衡量參數。
[0265] 實施例6環核苷酸熒光探針對生理條件下核苷酸類似物的響應特性
[0266] 滴定方法：對于本探針的體外檢測主要采取滴定方式進行，配制100mM的cAMP儲 液并將其用NaOH調至pH7. 4,以保證與待測樣品所處環境一致避免因 pH更變造成的干擾， 然后依次稀釋為0. 1，1，10,100,1000, lOOOOuM幾種濃度梯度待用。
[0267] 將待測蛋白樣品用緩沖液統一稀釋至終濃度luM，同時以緩沖液為空白對照 (pH7. 4)，以cpYFP蛋白為陰性對照，各樣品設兩個重復，加樣后于37°C孵育15~20min。正 式開始檢測后，首先讀取一個熒光初始值，然后向各樣品孔內從低到高依次滴加各濃度的 cAMP底物，每次滴定后震蕩5s并讀取下一次的熒光值。
[0268] 本發明熒光探針對生理條件下核苷酸類似物的響應特性，見下表：
[0269]
[0270]
[0271] 結果表明（附圖6)，本發明熒光探針對ATP、NAD及NADH后幾種信號分子基本無 響應，對cAMP的最高響應可達5倍左右，但對cGMP也有接近4倍的響應，但正常生理條件 下哺乳細胞內cAMP的水平為0. 1~luM (應激情況下可升高100倍以上），而cGMP在細胞 內的水平極低，僅為cAMP的1/10~1/50,事實上從圖6可看出，本發明熒光探針在0. 1~ 10uM范圍內對cGMP基本無響應，而對cAMP在5uM濃度下響應既已接近3倍，10uM濃度下 接近4倍，故表現出良好的特異性。
[0272] 實施例7環核苷酸熒光探針對生理條件下cAMP結合特性的檢測
[0273] 為掌握本發明中熒光探針具體的cAMP結合速率及反應飽和點等特性，我們通過 以下兩種滴定檢測方法進行實驗：
[0274] 1)分別取cpYFP及待測探針樣品，各樣品設定5個平行重復孔，檢測開始后首先讀 取初始熒光值，然后向5孔內分別同時加入0. luM，luM，10uM，100uM，lOOOuM五種濃度梯度 的cAMP，讀取5~lOmin的動力學。
[0275] 2)分別取cpYFP及待測探針樣品，各一孔即可，不必設眾多重復，同方法一，先讀 取樣品初始熒光值，然后仍采取滴定的方式由低至高