一種基因編碼的環腺苷酸熒光探針及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種基因編碼的環腺苷酸熒光探針及其制備方法和應用，具體涉及一 種基因編碼的環腺苷酸熒光探針、環腺苷酸（CAMP)檢測探針的制備方法和上述探針在檢 測活細胞內（包括大腸桿菌原核細胞及哺乳動物真核細胞）cAMP水平中的應用。
【背景技術】
[0002] CAMP作為一種信號小分子，廣泛存在于從低等微生物到高等哺乳動物的細胞組織 中，由三磷酸腺苷活化腺苷環化酶生成，然后通過激活cAMP依賴性蛋白激酶PKA使靶細胞 蛋白磷酸化，進而調節下游連續性的特異性信號級聯反應，從而在細胞內起傳遞激素和遞 質的中介作用，被稱為細胞內生命信息傳遞的的"第二信使"。cAMP在體內的作用幾乎遍及 各個組織器官，能夠廣泛參于包括激素分泌、肌肉收縮、離子通透等在內的細胞代謝活動， 另外在細胞生長與分裂、分化調節、炎癥反應、免疫反應、前列腺素作用中都起著重要作用， 因此cAMP本身及其代謝調節所涉及的眾多酶類成為了藥物設計的靶標。
[0003] 在哺乳動物除紅細胞外，所有組織中都有cAMP的分布，但是正常情況下細胞內 cAMP濃度一般低于10-6mol/L，而且在激素或應激作用下腺苷酸環化酶被激活會使cAMP水 平發生急劇變化，變化比例也會隨細胞狀態不同而有所差異，因此這給cAMP的測定帶來極 大不便。較傳統的檢測手段主要是免疫學方法，最早出現的是放射免疫法（RIA)，利用同位 素標記的與未標記的抗原同cAMP抗體發生競爭性抑制反應，通過研究機體對抗原物質反 應的發生、發展和轉化規律進而標定cAMP水平。但該方法存在一個最大的缺陷：其嚴重的 放射性。之后出現的酶聯免疫法（ELISA)缺陷則在于：1、操作步驟較多；2、當使用的cAMP 抗體未經過親和純化時其特異性不是很理想；3、在一些組織中，cAMP的含量不是很高，使 用傳統的顯色或發光方法，最終檢測的靈敏度不理想。其他如紙層析法、HPLC分析、熒光成 像等方法也常見于各類文獻報道中。然而，大部分方法都存在一定不足，包括檢測儀器及試 劑的復雜與昂貴，方法本身的污染性，檢測步驟的繁瑣等，特別需要指出的是，大部分方法 對單個細胞中祀標分子的靈敏度不足或者是不能進行亞細胞定位，而且最大的缺陷在于檢 測時需要對樣品進行裂解、分離、純化等操作，而在一系列繁瑣操作中極易引入誤差最終顯 示的結果與實際存在出入。另外，現有用于活體動物或細胞檢測的cAMP探針有以下幾種類 型，各自都存在嚴重缺陷：首先是化學染料熒光探針，此類探針在透膜方面有很大障礙，大 大降低了其利用范圍，且其激發波長一般位于紫外區，帶來的細胞損傷較大，而且可能會受 到生物樣品自發熒光的影響；其次是生物合成熒光探針，此類探針在現有研究報道中主要 表現為FERT模型，個體較為龐大在蛋白表達中易出現折疊問題，同時檢測過程中要涉及雙 熒光蛋白空間距離的變化，探針的靈敏度及檢測限也不理想。
[0004] 因此，本領域亟需發展一種特異性、直觀性和靈敏性的cAMP檢測技術，特別是一 種適合生物體生理水平和亞細胞水平的特異性cAMP檢測技術。
[0005] 相對于傳統的小分子化學探針而言，熒光蛋白探針在大多數的活體細胞中實現了 對靶標蛋白在細胞內的定位、分布和運動以及與其他細胞內分子的相互作用的標記和分 析，成為許多細胞內分子事件檢測的首選模型。
[0006] 綠色熒光蛋白是一類存在于腔腸動物體內的生物發光蛋白，最早于名為Aequorea victoria的水母中發現，是由238個氨基酸殘基組成的單鏈多肽，基因長達2. 6kD，由3個 外顯子組成，分別編碼69、98和71個氨基酸，天然GFP蛋白中第65-67位的三個氨基酸 Ser-Tyr-Gly能夠自發形成一個焚光生色基團。
[0007] 盡管對野生型GFP的生色團及其發光原理都有了一定程度研究，但其結構及光譜 性質等仍存在較多缺陷，隨著對GFP蛋白突變研究的逐漸深入，目前已經發展出許多表現 突出的GFP衍生物，優化后的GFP吸收光譜發生迀移，不但亮度提高，蛋白成熟速度也獲得 增加。借助于對GFP蛋白序列的重新排列，將原第145-238位氨基酸部分作為新蛋白的N 端，原1-144位氨基酸部分作為新蛋白的C端，兩片段之間通過一小段柔性的短肽鏈相連， 形成一個對空間變化敏感的環狀排列熒光蛋白，在此基礎上對原蛋白進行點突變就形成了 環狀排列的黃色熒光蛋白cpYFP。
[0008] 隨著熒光蛋白應用日益廣泛，相關的一些基于熒光的分析檢測方法也得到進一步 發展。例如FRET作為一種熒光能量轉移的現象，對于距離和熒光基團的空間取向高度敏 感，很多研究中通過FRET效率的測量來觀察一些生物分子的相互作用。現有研究報道利用 基因工程重組數段將期望研究的蛋白基因兩端分別于CFP與YFP融合來表達一個新的融合 蛋白，通過熒光的變化直觀的表現該蛋白與專一性的靶標分子結合所產生的空間變化。
[0009] 因此，本文所用的熒光蛋白序列可以來自于avGFP及其衍生物，包括但不局限于 這些突變體：黃色熒光蛋白（YFP)，綠色熒光蛋白（GFP)等的序列，其中優選環狀排列的黃 色熒光蛋白cpYFP的序列。
[0010] 本文涉及的另一種蛋白，Epac蛋白是一種本領域已知的被cAMP直接激活的交換 蛋白，由881個氨基酸組成，普遍存在于人體各組織中，最早在研究小分子G蛋白Rapl的活 化機制時被發現并分離，可在不同的亞細胞器如細胞核，細胞質，核膜等區域進行表達，其 具體定位主要取決于細胞的類型和細胞周期。Epac結構域包括一個調控區和催化區，除含 有既往GEFs的3個保守區域外，還含有REM和DEP功能區。REM對穩定GEFs結構有重要作 用，DEP功能區參與膜附著。其中關鍵的是Epac存在一個cAMP結合的疏水性口袋結構域， 該區域存在一些高度保守的序列，可以與cAMP的磷酸基團和核糖基團相互作用。
[0011] 雖然Epac蛋白在結合cAMP分子后其自身會發生明顯的構象變化，但該變化并不 能直觀的顯示出并被外界所捕獲，而借助于熒光蛋白這一工具，我們可以很好的融合二者 獲得一個全新的基因編碼熒光探針，利用Epac蛋白感受生理環境中cAMP水平的變化并將 這一變化傳遞到熒光蛋白，通過熒光蛋白產生熒光與否及熒光強弱，對機體或者細胞生理 狀態進行實時描述。
[0012] 綜上所述，我們認為，利用包含Epac蛋白的重組熒光融合蛋白能夠滿足在生理水 平和亞細胞水平上檢測cAMP的急切需要。
[0013] 本文所述參考文獻均引入本文。
【發明內容】
[0014] 本發明的第一個目的是提供一種基因編碼的cAMP熒光探針。
[0015] 本發明的第二個目的是提供一種包含編碼基因編碼的cAMP熒光探針的核苷酸序 列。
[0016] 本發明的第三個目的是提供一種基因編碼的cAMP熒光探針的制備方法。
[0017] 本發明的第四個目的是提供一種包含基因編碼的cAMP熒光探針的融合蛋白。
[0018] 本發明的第五個目的是提供一種包含編碼含有cAMP熒光探針的融合蛋白的核苷 酸序列。
[0019] 本發明的第六個目的是提供一種包含編碼cAMP熒光探針核苷酸序列的表達載 體。
[0020] 本發明的第七個目的是提供一種包含本發明所述表達載體的宿主細胞。
[0021] 本發明的第八個目的是提供一種基因編碼的cAMP熒光探針在檢測cAMP中的應 用。
[0022] 本發明的第九個目的是提供一種所述的熒光探針在監測活細胞內環核苷酸的變 化的應用。
[0023] 本發明的第十個目的是提供一種所述的熒光探針在高通量篩選過程中的檢測方 法。
[0024] 本發明的第十一個目的是提供一種試劑盒，其包含本發明所述的基因編碼的cAMP 熒光探針和說明書。
[0025] 本發明的技術方案如下：
[0026] -種基因編碼的cAMP熒光探針，其內含有熒光蛋白序列或其衍生物和對cAMP敏 感的多肽，其中所述對cAMP敏感的多肽，
[0027] (1)具有cAMP結合特性的CNBD結構域；和/或
[0028] (2)來源于對cAMP敏感的被cAMP直接活化調節的鳥嘌呤核苷酸交換因子Epac家 族蛋白。
[0029] 所述具有cAMP結合特性的CNBD結構域為序列表所示Epacl-CNBD氨基酸序列或 Epac2B-CNBD氨基酸序列。
[0030] 根據本發明所述基因編碼的cAMP熒光探針，所述對cAMP敏感的多肽為來自于真 核生物的交換因子Epac蛋白基因的多肽，該多肽的序列選自SEQ ID N0 :1、2、3和4。
[0031] 根據本發明所述基因編碼的cAMP熒光探針，所述熒光蛋白序列為環狀排列的黃 色熒光蛋白cpYFP如SEQ ID N0 :21所示。
[0032] 根據本發明所述基因編碼的cAMP熒光探針，所述熒光探針所包含的熒光蛋白序 列B和對cAMP敏感的多肽中具有cAMP結合特性的CNBD結構域A，所述B為序列表所示B1 和/或B2氨基酸序列，所述A為序列表所示A1和/或A2氨基酸序列；所述熒光探針的組 合形式是：
[0033] (l)A-B-A，其中B插入A的柔性區域內，將A分割成A的第一部分和A的第二部分， A的第一部分和A的第二部分共同構成完整的A結構域；
[0034] (2)A1-B-A2,其中A1和A2分別串聯在B兩端，A1和A2前后順序可變換；A1是來 自于人體或小鼠組織器官的交換蛋白或其衍生物的氨基酸序列，A2是來自于人體或小鼠組 織器官的另一交換蛋白或其衍生物的氨基酸序列。
[0035] 根據本發明所述基因編碼的cAMP熒光探針，優選的是，將cpYFP插入到Epac2B，插 入位點分別為 P/D (23/24)、H/L (58/59)、N/T (162/163)或 Q/D (171/172);將 cpYFP 插入到 Epacl，插入位點為 K/T (162/163)。
[0036] 所述的cAMP熒光探針優選SEQ ID NO :5、6、7、8、39、40、41、42、67所示的蛋白序 列。
[0037] 根據本發明所述基因編碼的cAMP熒光探針，所述熒光探針為具有以下結構：
[0038] A1_A2_LK1 _FP_LK2_A3_A4?
[0039] 其中，六1是Epac蛋白的第一結構域，優選來源于人體組織的Epacl蛋白的氨基酸 序列的氨基酸110-186如SEQ ID N0:13所示或人體組織的Epac2蛋白的氨基酸序列的氨 基酸 216-291 如 SEQ ID N0:14 所示；
[0040] A2是Epac蛋白的第二結構域，優選Epacl蛋白的氨基酸序列的氨基酸245-363,如 SEQ ID N0:15所示或Epac2蛋白的氨基酸序列的氨基酸356-476,如SEQ ID N0:16所示；
[0041] 六3是Epac蛋白的第三結構域，優選Epac 1蛋白的氨基酸序列的氨基酸384-518，如 SEQ ID N0:17所示或Epac2蛋白的氨基酸序列的氨基酸496-634,如SEQ ID N0:18所示；
[0042] A4是Epac蛋白的第四結構域，優選Epacl蛋白的氨基酸序列的氨基酸662-889， 如SEQ ID N0:19所示或Epac2蛋白的氨基酸序列的氨基酸772-1009,如SEQ ID N0:20所 示；
[0043] FP是熒光蛋白，選自GFP，YFP，CFP以及基于這些蛋白的變異體，優選YFP，更優選 cpYFP 如 SEQ ID N0:21 所示；
[0044] L&可以存在或不存在，存在時，1^1為1\六、3、6中一種或一種以上氨基酸；
[0045] LK2可以存在或不存在，存在時，LK2SG、S、T中一種或一種以上氨基酸。
[0046] 根據本發明所述基因編碼的cAMP熒光探針，優選的是，所述cAMP熒光探針為對熒 光蛋白序列和對cAMP敏感的多肽的連接處氨基酸肽段YNSD和LEYN進行截短的突變體。
[0047] 根據本發明所述基因編碼的cAMP熒光探針，進一步優選的是SEQ ID N0:51-66和 SEQ ID N0:68-83所示的氨基酸序列。
[0048] 根據本發明所述基因編碼的cAMP熒光探針，優選的是，所述cAMP熒光探針為對 cAMP熒光探針進行定點突變的突變體，所述突變為在Epac2B-CNBD氨基酸序列的93位、105 位、122位、123位、132位、133位、152位、156位、160位、412位上突變。
[0049] 根據本發明所述基因編碼的cAMP熒光探針，進一步優選的是SEQ ID N0:110-126 所示的氨基酸序列。
[0050] 本發明還提供一種編碼所述熒光探針的核苷酸序列，包括編碼對cAMP敏感的蛋 白質的核苷酸序列和編碼熒光蛋白的核苷酸序列。
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