L，NheI酶lyL，EcoRV酶lμL，H2039.5μL，37°C水浴鍋3 h。酶切完成后取出2yL樣品進行鑒定；
(3)重組慢病毒載體LV-EFla-PSA-2A-GFPWP R E連接、轉化、抽提及酶切鑒定連接體系為1yL: T4 DNA ligase 1Xbuffer lyL，載體片段2yL，目的片段6yL，T4 DNA Iigase 1μL，連接過夜。將連接產物取出5yL加入裝有感受態細菌(冰水混合狀態)Τ0Ρ10的1.5mL EP管中，冰浴30 min，42 °C水浴90 s，冰浴3 min，加入800yL LB液體培養基，30°C，280 r /min振蕩培養I h;5 000 r /min離心2 min，棄上清，留200yL吹打混勾后加入氨節抗性的LB固體培養基上，用三角形玻璃棒涂勻，平板放入30 0C恒溫箱中培養過夜。挑取飽滿的菌落于1:1 000的氨芐LB液體培養基中，30°C，280 r /min，振蕩培養12 h。抽提方法參照美國Invitrogen公司質粒抽提試劑盒抽提，完成后取出2yL樣品進行鑒定。
[0017]實施例2 CAR-T病毒包裝:
采用4質粒系統進行病毒包裝，4質粒系統分別表達病毒載體包裝所需的gag/pol，Rev，VSV-G，及工程穩定的單鏈抗體構成的人工嵌合抗原受體。將4質粒按比例進行瞬時轉染。總質量為10yg。將上述質粒加入至一定體積的無菌水中，隨后加入ΙΟΟμΙ 2.5 mmol /L的
CaC12，向混合液中緩慢滴加2 XHBS溶液500μ1，將上述溶液加入至鋪有293T細胞的培養皿中，輕輕混勻，置于37 0C、5%C02培養箱中培養12h，加入含10%FBS的DMEM液體培養基8mL，繼續培養48小時。收集轉染后48h后的T細胞上清液，于4°C，2000r/min，離心5分鐘，除去細胞碎片，用0.45μπι濾器過濾上清液并分裝，保存在-70°C。
[0018]實施例3T細胞的分離與擴增培養:
1)原血預處理:抽取患者外周血100ml并加入10yL肝素抗凝劑，然后分裝到4個50ml的離心管；用生理鹽水I: I對血液進行稀釋并用移液管吹打混勻；
2)Ficoll法分離:將稀釋后的血液小心加到含有15mlFicoll淋巴細胞分離液的50ml離心管中，每管約35ml，室溫2000rpm離心20分鐘；
3)T細胞的收集與洗滌:吸取兩液面交接處的細胞層到50ml離心管內，用生理鹽水補充至30ml混勻，室溫2000rpm離心10分鐘，待細胞沉淀后洗滌兩次；
4)T細胞的擴增培養:將T細胞濃度調整為2X 106個/皿接種到10mm培養皿中，置于370C、5% C02培養箱中培養，待融合至80-90%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，擴大培養T細胞數為108-109，收集T細胞備用。
[0019]結果如圖1所示，經過擴增培養12天后，T細胞擴增比例高于初始T細胞100倍以上，說明了經過上述培養方式，可以在短時間內擴增T細胞;用臺盼藍染色測定T細胞活力，結果如圖2所示，細胞活力逐漸提高。
[0020]實施例4CAR-T細胞的轉染與制備:
1)將20yg的RetroNectin，包備于6孔板內，置于37°C、5%C02培養箱內培養3h;
2)吸取RetroNectin，利用含2.5%BSA的Hank’s封閉包備后的6孔板，置于37°C、5% C02培養箱內培養Ih;
3)吸取封閉液，利用含2%!fepes的他111^溶液洗滌6孔板。加入含10°/洲5的01^液體培養基，并加入適量的經過包裝的病毒溶液，2000r/min，離心5分鐘；
4)棄上清，加入2\106的1'細胞，150(^/11^11，離心5分鐘。置于37°(:、5%C02培養箱內培養，12h后重復上述步驟。感染5天后進行細胞收集，制備CAR-T細胞，感染后5天測定scFv的表達，通過流式細胞儀檢測scFv的表達。結果如圖3所示，經過慢病毒感染后的T細胞表面表達高陽性scFv，同時再次培養15天后，其scFv的表達任有91.9%，并未丟失表達。
[0021]實施例5CAR-T細胞對前列腺癌細胞殺傷率檢測:
將本發明制備CAR-T細胞作為效應細胞進行殺傷活性測定，實驗組靶細胞為PSA表達陽性的前列腺癌細胞PC3，對照組靶細胞為PSA表達陰性的前列腺癌細胞PC3 ο按照效應細胞與靶細胞比例為5:1加入96孔培養板中，在37°C 5%C02培養過夜，采用MTT法測定波長為570nm處吸光度，結果如圖3所示。
[0022]結果顯示，本發明實驗組所制備的CAR-T細胞對PSA表達陽性的前列腺癌細胞PC3的特異性殺傷活性74.9%，顯著高于對照組21.4%(P〈0.01)。說明本發明制備的PSA特異性的CAR-T細胞具有殺傷PSA陽性細胞的功能。
【主權項】
1.一種治療前列腺癌的CAR-T細胞制劑，其特征在于:由嵌合了靶細胞抗原受體hPSAscFv-CD8-CD28-CD3G的CAR-T細胞、人血白蛋白、生理鹽水按一定比例配制而成，制劑的優選配比為:CAR-T細胞的濃度為(4?6 ) X 1 7個/ml，質量體積比為2%的人血白蛋白，余量為生理鹽水。2.根據權利要求1所述CAR-T細胞中CAR為hPSAscFv-CD8-CD28-CD3G，CAR的具體組成為:由抗人PSA單克隆抗體ant1-PSA輕鏈和重鏈可變區hPSAscFv、CD8鉸鏈區、CD28跨膜區和胞內區、以及CD3G胞內信號區串聯構成。3.根據權利要求1所述一種治療前列腺癌的CAR-T細胞制劑的制備方法，主要包括以下步驟: (1)載體構建:構建能夠表達hPSAscFv-CD8-CD28-CD3G的載體； (2)轉染T細胞的病毒的包裝:采用步驟(I)中構建的載體包裝慢病毒，獲得經過包裝的慢病毒； (3)T細胞分離與擴增培養:抽取患者自身血液，從中分離出T細胞并進行擴增培養； (4)Τ細胞的轉染與制備:采用步驟(2)中經過包裝的慢病毒對步驟(3)中培養所得T細胞進行轉染并擴增培養，獲得CAR-T細胞； (5)將步驟(4)制備的CAR-T細胞與人血白蛋白按比例混勻，余量用生理鹽水補足，制備成CAR-T細胞制劑。4.如權利要求2所述的嵌合抗原受體hPSAscFv-CD8-CD28-CD3G在制備嵌合抗原受體T細胞及其在前列腺癌治療藥物中的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種治療前列腺癌的CAR-T細胞制劑及其制備方法，本發明的制劑由CAR-T細胞、人血白蛋白、生理鹽水按一定比例配制而成。本發明所制備嵌合抗原受體（CAR）是hPSAscFv-CD8-CD28-CD3ζ，該嵌合抗原受體由抗人PSA單克隆抗體anti-PSA輕鏈和重鏈可變區（hPSAscFv）、CD8鉸鏈區、CD28跨膜區和胞內區、以及CD3ζ胞內信號區串聯構成。該嵌合抗原受體用于修飾T淋巴細胞，修飾后的T細胞（CAR-T細胞）用來治療PSA陽性的前列腺癌，治療效果顯著，從根本上提供了一種治療前列腺癌的方法。
【IPC分類】A61K35/17, C12N15/867, A61P35/00
【公開號】CN105640991
【申請號】
【發明人】周萱
【申請人】奧思達干細胞有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年1月6日