一種治療前列腺癌的car-t細胞制劑及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種治療前列腺癌的CAR-T細胞制劑及其制備方法。
【背景技術】
[0002]嵌合抗原受體是模擬T細胞受體功能的人工受體，由抗原識別結構域(配體或單鏈抗體)和T細胞的一系列信號結構域依次連接而成。利用嵌合抗原受體修飾T細胞能夠將配體或抗體的特異識別作用與T細胞的效應功能聯合起來，進行腫瘤靶向免疫治療。此療法是對人體自身T細胞加以改造后用于治療，相對于放和化療，其毒副作用較弱。由于嵌合抗原受體修的T細胞通過其抗原識別結構域識別腫瘤細胞表面抗原，然后啟動殺傷作用，因此其治療具有靶向性。由于該種T細胞通過其嵌合抗原受體直接識別腫瘤細胞表面抗原，然后通過其信號結構域直接將識別信號傳速至胞內，激活T細胞的殺傷活性，因此可以繞開常規細胞免疫的主要組織相容復合體(MHC)限制性，從而有效克服腫瘤細胞MHC表達量低造成的免疫逃逸，并可以靶向非蛋白質腫瘤抗原。
[0003]前列腺癌(Prostate Cancer，PCa)是常見男性泌尿系統惡性腫瘤，其死亡率已超過肺癌，成為嚴重威脅男性健康第二大惡性腫瘤。雖然早期PCa易治療，生產率高，但是三期、四期PCa死亡率高，且易出現骨轉移。PCa目前的治療方式主要有手術，放療和化療。PCa切除術手術創傷大、術后尿失禁和勃起功能障礙的發生率極高，且手術死亡率亦高;而放療和化療帶來的副作用大，會嚴重影響患者的生活質量。
[0004]PSA是一種含有237個氨基酸的單鏈多肽，具有組織特異性，只存在于人前列腺腺泡及導管上皮細胞胞漿中，不表達于其它細胞，血清PSA是前列腺癌的特異性標志物，而在正常細胞不表達。因此，PSA是前列腺癌靶向治療的潛在位點。國外已有報道抗CD19-CAR-T細胞在B細胞腫瘤中的應用取得了良好的治療效果，因此利用抗PSA-CAR-T細胞構建的嵌合抗原受體hPSAscFV-CD8-CD28-CD3G表達于T細胞表面，使T細胞特異性殺傷PSA陽性的腫癌細胞，提高前列腺癌的治療效果和晚期前列腺癌癥患者的生存率，為前列腺癌患者的臨床治療提供一種新的方法。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題是，提供一種新的有效的前列腺癌治療方法，利用抗PSAscFv構建出的抗PSA嵌合抗原受體(hPSAscFv-CD8-CD28-CD3G)，表達該嵌合抗原受體的CAR-T細胞也具有其獨特性，初步研究其腫瘤特異性殺傷功能，以進一步探討其在臨床治療中的應用。
[0006]為實現上述技術目的，達到上述技術效果，本發明通過以下技術方案實現:
一種治療前列腺癌的CAR-T細胞制劑，由嵌合了靶細胞抗原受體hPSAscFV-CD8-CD28-
⑶3ζ的CAR-T細胞、人血白蛋白、生理鹽水按一定比例配制而成。制劑的優選配比為:CAR-T細胞的濃度為(4?6) X 107個/ml，質量體積比為2%的人血白蛋白，余量為生理鹽水。
[0007]進一步的，所述CAR-T細胞中CAR為hPSAscFv-CD8 -CD28_CD3G，具體組成為:由抗人PSA單克隆抗體ant1-PSA輕鏈和重鏈可變區hPSAscFv、CD8鉸鏈區、CD28跨膜區和胞內區、以及CD3G胞內信號區串聯構成；
進一步的，所述CAR-T細胞的靶細胞抗原為PSA。
[0008]進一步的，所述CAR-T細胞由一種表達載體所表達，其中，表達載體為慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒的一種，優選慢病毒。
[0009]—種治療前列腺癌的CAR-T細胞制劑的制備方法，主要包括以下步驟:
(1)載體構建:構建能夠表達hPSAscFv-CD8-CD28-CD3G的載體；
(2)轉染T細胞的病毒的包裝:采用步驟(I)中構建的載體包裝慢病毒，獲得經過包裝的慢病毒；
(3)T細胞分離與擴增培養:抽取患者自身血液，從中分離出T細胞并進行擴增培養；
(4 )Τ細胞的轉染與制備:采用步驟(2 )中經過包裝的慢病毒對步驟(3 )中培養所得T細胞進行轉染并擴增培養，獲得CAR-T細胞；
(5)將步驟(4)制備的CAR-T細胞與人血白蛋白按比例混勻，余量用生理鹽水補足，制備成CAR-T細胞制劑。
[0010]本發明相對于現有技術具有以下優點和效果:
(1)本發明首次將嵌合了前列腺癌細胞抗原受體的CAR-T細胞，用來治療前列腺癌，治療效果顯著，從根本上提供了一種治療前列腺癌的方法；
(2)本發明首次將嵌合了前列腺癌細胞抗原受體的CAR-T細胞與人血白蛋白聯合制作成一種靶向治療前列腺癌的免疫細胞制劑，人血白蛋白可以維持CAR-T細胞的活性。本制劑成分明確，制作簡便，為CAR-T細胞的臨床推廣應用提供了更便捷的方法；
(3 )本發明所選用的靶細胞抗原為PSA: PSA是前列腺癌的最重要的特異性標志物。70-80%的前列腺癌病人在發病期間都有PSA基因高表達的特征，PSA幾乎表達于所有的前列腺癌細胞表面，而在其他細胞表面幾乎不表達，在臨床上被認為是前列腺癌的經典腫瘤標記物。因此采用PSA作為靶細胞抗原可以大大提高使CAR-T細胞特異性識別和殺傷前列腺癌細胞的能力，降低前列腺癌患者的復發和提高治療效果；
(4)本發明采用的是第三代CAR，第三代CAR的重組T細胞能夠增加γ-干擾素和抗細胞凋亡蛋白的分泌，在抗腫瘤活性、存活周期及細胞因子釋放方面均顯著提高。
[0011]上述說明僅是本發明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發明的技術手段，并可依照說明書的內容予以實施，以下以本發明的較佳實施案例并配合附圖詳細說明如后。本發明的【具體實施方式】由以下實施例及其附圖詳細給出。
【附圖說明】
[0012]圖1表示從患者外周血分離得到的T細胞體外培養擴增曲線。
[0013]圖2體外培養擴增所得T細胞的活力測定。
[0014]圖3顯示用不同MOI值的慢病毒感染T細胞的感染效率(用FITC-標記的蛋白檢測s cFv在T細胞上的表達率)。
[0015]圖4顯示CAR-T細胞對PSA表達陽性的前列腺癌細胞PC3的特異性殺傷率。
【具體實施方式】
[0016]實施例1 CAR-T細胞表達載體構建:
(1)PCR擴增目的片段抗PSA抗體以pCDNA3-scBW431/26-hFc質粒為模板設計引物，在其5 ’、3 ’端分別加上Nhe1、Sal I限制性內切酶位點，CEA Up NheI上游引物5 ’ -AGG CTAGCATGGGATAGGAG CTG TATCAT-3 ' , PSA-HER2 Dn SalI 下游引物 5'-AGGTCGACGGTATCGAATAAGCTTTG-3 ’，反應條件95 °C 預變性5min ,95 °C 變性 I Os，68 °C 退火 15s，72°C延伸30 s，30個循環，擴增完成后取出2yL樣品進行鑒定；
(2)雙酶切LV-EFla-Luciferase-PGK-FP635-WPRE載體、目的片段PSA--CD3-2A-GFP載體酶切體系為50yL: 10 XGreen buffer 5yL，載體3yL，NheI酶lyL，SalI酶lyL，H20 40yL；目的片段酶切體系為50yL: 10 XGreen buffer 5yL，目的片段回收產物2.5y