ddPCR微滴發生油)一支，7ml;溶液G為ddPCR探針法質控液，3.5ml; 溶液Η(陽性對照）一支，40化;溶液I (陰性對照）一支，使用豬流行性腹瀉病毒(P抓V) 和傳染性胃腸炎病毒(TGEV)RNA混合液為陽性模板，使用化is-EDTA緩沖液(0.01M P冊.0) 稀釋后冷凍保存。將檢驗合格的陽性對照制劑按4(Κ)化定量分裝。使用RNAse Free地2〇為 陰性對照。
[0080] 上述一步法ddPCR探針法預混液其900化的配方為：500化的2乂〇116-3169削- ddPCR SupermiX，P邸V上、下游引物分別為90化，TGEV上、下游引物分別為90化，P抓V和TGEV 的特異探針分別為20yL，引物和探針的濃度均為ΙΟμΜ。
[0081 ] 使用時，在1祉L的ddPCR探針法預混液中加入化L的RNA模板，得到20化的ddPCR反 應液，用于制備微滴。
[00劇 2、總RNA提取
[0083] 取10化L組織樣品研磨上清液置1.5mL邱pendorf管中，加500化溶液A，混勻，室溫 劇烈震蕩15s，室溫靜置5min。加120化溶液B，小屯、蓋上帽蓋，室溫劇烈震蕩15s，室溫放置 5min。12,000rpm，4°C，離屯、15min，可見分為Ξ層，上層水相含RNA。轉移水相至一新 e郵endo;rf管，加入等量溶液C(約500yL)，混勻，室溫放置15min。12,000;rpm，4°C，離屯、 lOmin，離屯、后在eppendorf管邊和底部可見有膠樣RNA沉淀。洗RNA:棄上清，加100化L 75% 乙醇（使用前用溶液D加無水乙醇配置而成，-20°C預冷）漂洗沉淀，12000巧m，4°C，離屯、 5min，棄上清。室溫充分干燥RNA沉淀。加1扣L RNAse化ee地20，即可用于PCR擴增。可W-20 °C保存備用。
[0084] 3、雙重ddPCR方法的建立
[0085] (1)制備ddPCR反應液，總體積20yL。向擴增管中加入下列反應物：
[0086]
[0087] 空白對照：WRNAse Free地2〇代替模板，同樣條件下擴增。
[0088] (2)將SOliL反應液加入到微滴發生卡中間一排的8個孔內，不足8個樣品時用20μΙ IX溶液巧l·足，建議使用8通道20化排槍和20化槍頭(不能用200ul槍頭），加樣時槍頭接近 孔一側底部，與側壁呈大約15°角，緩慢打出液體，打出一部分后慢慢提升槍頭位置再打出 余下液體，不要將槍按至超過第一檔位置W免引入氣泡。
[0089] (3)在微滴發生卡最底下一排8個孔中各加入70化微滴生成油，同樣不能有空著的 孔。
[0090] (4)蓋上膠墊，注意兩邊的小孔都要鉤牢。
[0091] (5)將W上卡托輕輕地平穩放置于微滴生成儀中，開始生成微滴，注意儀器上指示 燈狀態，一般2分鐘之內完成。
[0092] (6)微滴生成于微滴發生卡最上面一排孔內，建議使用8通道排槍和20化L槍頭小 屯、緩慢吸取，調整吸取體積為40化，將卡托放平，槍頭W與孔壁呈30~45°角放入，輕觸孔 底，約5秒吸取40ul，再同樣緩慢地打入96孔板相應位置孔內（約5秒），槍頭貼近孔壁接近孔 底，注意封上蓋W防油揮發，每次棄去已使用過的微滴發生卡和膠墊。
[0093] (7)封好膜之后應該在30分鐘內進行PCR反應，或者放于4°C冰箱4小時之內進行 PCR，可在任意一臺96孔PCR儀上完成，注意升降溫速度^2.5°C/s。推薦反應條件：
[0094]
[00M] (8)將之前完成PCR的96孔板放入plate holder中組裝好，注意板斜角方位，組裝 好之后輕輕地平穩放入微滴讀取儀中。
[0096] (9)打開QuantaSoft軟件，建議每次實驗之前做一次系統清洗，若一周W上未使用 建議先做一次填充油路再做系統清洗。之后對96孔板中樣品信息進行設置，主要是提供實 驗名稱、實驗類型W及探針信息等，完成后即可運行儀器，結束后結果會被自動分析，人工 核實后保存結果。
[0097] 4、結果分析和判定
[0098] 本發明試劑盒檢測結果的判定方法為：（1)陽性對照:20±2個拷貝；（2)陰性對照： <1個拷貝；待測樣本結果判定：（1)陽性:標本檢測結果含1個拷貝。（2)陰性:標本檢測結果< 1拷貝。
[0099] 實施例6本發明試劑盒的特異性評價
[0100] 按實施例5建立的方法，同時檢測豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒、豬細 小病毒，豬圓環病毒，豬藍耳病病毒，豬攝病毒六種病毒，W驗證本發明試劑盒的特異性。
[0101] 用W上6種病毒為模板，用豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒雙重微滴數 字PCR絕對定量檢測試劑盒上數字PCR檢測系統檢測。結果:豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性 胃腸炎病毒為陽性，豬細小病毒，豬圓環病毒，豬藍耳病病毒，豬攝病毒六種病毒都為陰性。
[0102] W上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人 員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可W做出若干改進和潤飾，運些改進和潤飾 也應視為本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種用于檢測豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒的特異性引物和探針組合， 其特征在于，包括以下2對特異性引物和2條與引物對配合使用的特異探針，其核苷酸序列 分別為： PEDV-F1：CACCATCAGCACCTCTTTC； PEDV-R1：CCAGTGCTCATGATCAAAA； PEDV-P1：FAM-CGACAACACCGTTACCATTATCTAGGA-BHQ1； TGEV-F1：CAGGGTAGTGAGTATGATTAC； TGEV-R1：CAACCTTTGCTCTCGTAA； TGEV-P1：HEX-ACACAGACCTCCGATACACAGC-BHQ1〇2. 權利要求1所述的特異性引物和探針組合在制備豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸 炎病毒雙重微滴數字PCR絕對定量檢測試劑盒中試劑的應用。3. -種含有權利要求1所述特異性引物和探針組合的試劑盒。4. 如權利要求3所述的試劑盒，其為雙重微滴數字PCR絕對定量檢測試劑盒。5. 如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，還包含病毒總RNA萃取試劑和一步法微滴 數字PCR檢測試劑;所述一步法微滴數字PCR檢測試劑包括無 RNA酶的蒸餾水，一步法ddPCR 探針法預混液，探針法ddPCR微滴發生油，質控液，陰性對照和陽性對照。6. 如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性對照為豬流行性腹瀉病毒和豬傳 染性胃腸炎病毒RNA混合液，陰性對照為無 RNA酶蒸餾水。7. 如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述一步法ddPCR探針法預混液其900yL的 配方為：500yL的2X One-step RT-ddPCR Supermix，PEDV上、下游引物分別為90yL，TGEV上、 下游引物分別為90yL，PEDV和TGEV的特異探針分別為20yL，引物和探針的濃度均為1 ΟμΜ。8. 如權利要求4-7任一所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的工作程序為： (1) 配制ddPCR反應液;ddPCR反應液20yL配方為:一步法ddPCR探針法預混液18yL，待測 樣品RNA模板為2yL; (2) 制備微滴，然后將微滴轉入PCR板，于PCR儀中進行擴增； (3) 將完成PCR擴增的PCR板放入微滴分析儀中，檢測微滴，分析數據，顯示檢測結果。9. 如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，步驟（2)中PCR的擴增程序為50°C反轉錄 lOmin; 95°C 預變性 lOmin; 94°C 變性 30sec，54~56°C退火 60sec，共 40 個循環；98°C lOmin 結 束反應，每步都設置2.5°C/sec的降溫速度。10. 權利要求3-9任一所述的試劑盒在豬疫病檢測和預防中的應用。
【專利摘要】本發明提供了一種用于檢測豬流行性腹瀉病毒(PEDV)和豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)的特異性引物和探針組合，包括2對特異性引物和2條與引物對配合使用的特異探針；同時提供一種用于檢測豬流行性腹瀉病毒(PEDV)和豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)的檢測試劑盒或檢測試劑。具有快速、敏感、特異等優點，可為豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒雙重微滴數字PCR絕對定量檢測、流行病學調查及疫苗使用等奠定基礎。
【IPC分類】C12Q1/68, C12Q1/70, C12N15/11
【公開號】CN105543416
【申請號】CN201610059807
【發明人】陳晨, 柴方紅, 王楠, 于欽磊, 穆國冬, 馬付坤, 閆慧, 張靜依
【申請人】北京佰鷗創投生物科技有限公司
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2016年1月28日