豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒雙重微滴數字pcr絕對定量檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及試劑盒檢測技術領域，具體的說設及一種豬流行性腹瀉病毒和豬傳染 性胃腸炎病毒數字PCR絕對定量檢測方法和檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea,PED)是世界范圍內發生的豬病之 一，W腹瀉、嘔吐、脫水和對哺乳仔豬高致死率為主要特征。PEDV與豬傳染性胃腸炎病毒 (TGEV)同屬于尼多病毒目、冠狀病毒科、冠狀病毒屬，兩種病毒的致病機理W及引起的臨床 癥狀極其相似，給養豬業帶來嚴重危害。運兩種病的主要傳染源是病豬，通過病豬排泄出的 糞便散播病毒，進而污染飼料、飲水和周圍環境，健康豬只通過口接觸到含有病豬的糞便或 其污染物即可發生自然感染。而且各年齡的豬均易感染，母豬的發病率為15%~90%，而仔 豬和育成豬的發病率通常為100%。病毒傳入豬群的途徑主要是通過運輸病豬的車輛或者 被病毒污染的飼料，W及被病毒污染的鞋、褲、衣物或其它攜帶病毒的污染物。運兩種病多 發生于寒冷季節，主要是在每年的11月至下年4月間發病，尤其在農歷春節前后更是該病的 發病高峰期。一般情況下氣溫超過20°C不會流行本病，但近年來也有在夏季發生的病例。
[0003] 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所于2005年~2007年間，對國內部分省、市豬場 腹瀉病例進行了RT-PCR檢測，結果表明，豬流行性腹瀉病(PED)病例占46%、豬傳染性胃腸 炎(TGE)病例占15%、豬輪狀病毒(PoRV)病例占8%，而PED、TGE和化RV相互間混合感染的病 例占31%。各項研究都表明如何防治死亡率高的豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎，是擺在 我們面前的新課題。
[0004] 目前，對運兩種傳染病的診斷方法主要有病毒中和試驗，免疫巧光法，免疫電鏡 法，ELISA法和RT-PCR法。隨著分子生物學的不斷發展，ELISA法和RT-PCR法W其敏感性高、 特異性強越來越受到人們的重視。傳統的檢測方法，如病毒中和試驗(VNT)、免疫巧光法、免 疫電鏡法、酶聯免疫吸附試驗等，存在需要時間長、依賴于經驗豐富的檢測人員、試驗操作 復雜、設及活病毒操作、對檢測環境要求較高，W及敏感性較低和重復性較差等諸多不足。 RT-PCR等核酸檢測方法，雖然較之傳統方法具有特異性更強、靈敏度更高、自動化程度更高 和結果重復性更好等優勢，但是僅能實現豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬流行性腹瀉病毒 (P抓V)的定性和半定量檢測，無法對TGEV和PEDV核酸進行精確的絕對定量檢測，從而檢測 結果無法反映樣品中病毒感染的真實情況。同時RT-PCR方法在靈敏度和特異性上仍存在一 定的局限性，對于病毒核酸提取過程中的某些化學物質較為敏感，進而抑制PCR反應，出現 "假陰伴'結果。
[0005] 數字化PCR(Digi化1 PCR，dPCR)的概念早在1999年就由BedVogelstein采用并發 表相關文獻，其初衷是為了能夠從臨床樣品（如尿液、淋己液、血漿、糞便等)大量的正常體 細胞中檢測出微量的突變細胞，但由于當時能用于稀釋樣品的耗材只是384孔板，因此還不 能非常好地體現數字PCR的核屯、理念--"無限稀釋"（terminal dilution) eBio-Rad公司 的QX200系統核屯、的微滴化技術能夠將一份樣品分成20,000個納升級的微滴，本質上將傳 統定量PCR的一個test變成20,000個test,大大提高了核酸序列檢測的靈敏度和精準度，是 對"無限稀釋"運一概念的完美演繹，其方法原理可稱為微滴式數字化PCR(化oplet Digital PCR，ddPCR) dQX200 ddPCR系統包括兩臺儀器:微滴發生器和微滴分析儀，及其相 關的耗材。微滴發生器將每個樣品分成20,000個均勻的納升級微滴，其中每個微滴或不含 待檢核酸祀分子，或者含有一個至數個待檢核酸祀分子。每個微滴都作為一個獨立的PCR反 應器。隨后微滴轉移至96孔PCR板上，開展終點PCR擴增。采用微滴分析儀(化oplet reader) 逐個對每個微滴進行檢測，有巧光信號的微滴判讀為1，沒有巧光信號的微滴判讀為0,最終 根據泊松分布原理W及陽性微滴的比例，分析軟件可計算給出待檢祀分子的濃度或拷貝 數。與傳統的定量PCR相比，數字PCR的精確度和靈敏度更佳。利用微滴式數字PCR技術，研究 人員可W檢測稀有突變，精確測定拷貝數變異，并對基因表達進行絕對定量。癌癥相關突變 因濃度較低，往往逃過檢測。憑借QX200系統的高靈敏度，研究人員如今可檢測濃度低至1/ !，000,000的祀分子。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一種具有高靈敏度、高特異性、高準確度和精確度，可實現 精確定量的數字PCR檢測方法和數字PCR檢測試劑盒，能夠同時檢測出豬流行性腹瀉病毒 (PEDV)和豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)的雙重微滴數字PCR絕對定量檢測方法。用于豬流行 性腹瀉病毒和傳染性胃腸炎病毒的快速定量精確檢測。
[0007] 本發明的第一個技術目的是提供用于檢測豬流行性腹瀉病毒(P抓V)和豬傳染性 胃腸炎病毒(TGEV)的特異性引物和探針組合，包括W下2對特異性引物和2條與引物對配合 使用的特異探針，其核巧酸序列分別為：
[0008] 陽DV-F1:CACCATCAGCACCTCTTTC;
[0009] 陽DV-R1:CCAGTGCTCATGATCAAAA;
[0010] 陽DV-P1:FAM-CGACAACACCGTTACCATTATCTAGGA-B冊1;
[0011] TGEV-F1:CAGGGTAGTGAGTATGATTAC;
[0012] TGEV-R1：CAACCTTTGCTCTCGTAA；
[0013] TGEV-P1:HEX-ACACAGACCTCCGATACACAGC-B冊1。
[0014] 本發明提供了上述的特異性引物和探針組合在制備豬流行性腹瀉病毒(PEDV)和 豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)檢測試劑盒或檢測試劑中的應用。
[0015] 本發明提供了一種含有上述特異性引物和探針組合的試劑盒。所述試劑盒優選為 雙重微滴數字PCR絕對定量檢測試劑盒。
[0016] 本發明的另一技術目的在于提供一種具有高靈敏度、高特異性、高準確度和精確 度的、操作簡單的檢測豬流行性腹瀉病毒(P抓V)和豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)的雙重微滴 數字PCR絕對定量檢測試劑盒，其中包含2對特異性引物和2條與引物對配合使用的特異探 針，其核巧酸序列分別為：
[0017] 陽DV-F1:CACCATCAGCACCTCTTTC;
[001 引 陽DV-R1:CCAGTGCTCATGATCAAAA;
[0019]陽DV-P1:FAM-CGACAACACCGTTACCATTATCTAGGA-B冊1;
[0020] TGEV-F1:CAGGGTAGTGAGTATGATTAC;
[0021] TGEV-Rl：CAACCTTTGCTCTCGTAA；
[0022] TGEV-Pl:HEX-ACACAGACCTCCGATACACAGC-B冊1。
[0023] 還包含病毒總RNA萃取試劑和一步法微滴數字PCR檢測試劑;所述一步法微滴數字 PCR檢測試劑包括無 RNA酶的蒸饋水，一步法ddPCR探針法預混液，探針法ddPCR微滴發生油， 質控液，陰性對照和陽性對照。
[0024] 所述病毒總RNA萃取試劑含有TRIz化、氯仿或異戊醇、異丙醇。所述一步法ddPCR探 針法預混液其90化L的配方為：
[00巧]500化的2X One-st邱 RT-ddPCR Supermix，PEDV上、下游引物分別為gOiiUTGEV 上、下游引物分別為90化，陽DV和TGEV的特異探針分別為20化，引物和探針的濃度均為10μ Μ。
[0026] 所述陽性對照為豬流行性腹瀉病毒(Ρ邸V)和豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)RNA混合 液，陰性對照為無 RNA酶蒸饋水。
[0027] 本發明的試劑盒其工作原理是采用雙重微滴式數字化PCR(ddPCR)，所述試劑盒的 工作程序為：
[0028] (1)配制ddPCR反應液;ddPCR反應液20化配方為:一步法ddPCR探針法預混液1祉L， 待測樣品RNA模板為
[0029] (2)制備微滴，然后將微滴轉入PC財反，于PCR儀中進行擴增；
[0030] (3)將完成PCR擴增的PC財反放入微滴分析儀中，檢測微滴，分析數據，顯示檢測結 果。
[0031] 在本發明的一個實施例中，制備微滴的方法是采用Bio-Rad公司的QX200系統中的 微滴發生器，按照說明書操作進行微滴制備即可。
[0032] 其中，步驟(2)中PCR的擴增程序為50°