塑料基板的下端，其上部黏附于硝酸纖維素膜8的下端，箭頭指示膠7用于將硝酸纖維素膜8與樣本墊M3 5、膠體金墊6固定住。
[0041]在硝酸纖維素膜8上設有質控C線1、檢測Tl線2-1和檢測T2線2-2，便于觀察判定檢測結果，質控C線上包被羊抗鼠多抗，檢測Tl線上包被有副溶血弧菌抗體，檢測Τ2線上包被有無乳鏈球菌抗體。
[0042]在吸收墊9外層附有彩色標記膠帶，其下端與硝酸纖維素膜上端外層相交1mm，另一端翻過塑料基板3上緣，貼于塑料基板被面，作為該檢測試條的特征標識。
[0043]將組裝成型的試劑條用全自動切條機切成3.5mm規格。
[0044]本發明的目的可以通過以下措施來達到:
[0045]1.副溶血弧菌單抗/無乳鏈球菌單抗的制備
[0046]小鼠腹腔注射液體石蠟0.5ml，I周后，將副溶血弧菌、無乳鏈球菌單抗雜交瘤細胞分別注射于以上預先處理過的BALB/C小鼠腹腔，每只小鼠注射雜交瘤細胞I?3X10、10天后收獲腹水，以上過程皆在無菌條件下完成。腹水經DEAE離子交換層析及Sephacryl S 300分子篩對單抗進行純化;SDS—PAGE平板電泳檢測純化單抗的純度;ELISA法測定單抗活性；測定各單抗效價(要求大于1:5000)。
[0047]2.羊抗DOAt高效價免疫抗血清的制備和純化
[0048]I)純化好的上述單抗+完全佐劑—免疫山羊—加強免疫二次，每次間隔一月—第二次加強后10天左右取血4離心取血清4硫酸銨沉淀—DEAE離子交換層析純化；
[0049]2)效價測定:ELISA夾心法，抗體效價稀釋度應大于1:256;
[0050]3)蛋白濃度測定:紫外分光法測定OD279，計算蛋白濃度。
[0051 ] 3.膠體金及金標抗體制備
[0052]I)膠體金的制備:以檸檬酸鹽還原法制備40 — 60 nm的膠體金。將0.01% HauCl4加熱至沸，加入一定量的1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7.2H20)，繼續加熱煮沸5分鐘，待膠體金溶液顏色由蘭—紫—紅，穩定后，冷卻即可。膠體金溶液應清亮透明，如需長期保存，可加入
0.02%ΝβΝ3ο
[0053]2)將膠體金液500ml用0.1M NaOH調pH7_8，磁力攪拌下緩慢加入副溶血弧菌單抗、無乳鏈球菌單抗各2 ml，攪拌20分鐘。7000rpm離心30Min，除去上清液中未結合的蛋白質。離心后吸取膠體金標記抗體沉淀，沉淀溶于10 ml保存液中，用0.45μπι微孔濾膜過濾。取樣進行檢定，其余置4°C保存。
[0054]4.膜反應體系硝酸纖維素膜的制備
[0055]I)將副溶血弧菌單抗、無乳鏈球菌抗體及純化的羊抗鼠IgG以0.1M磷酸鹽緩沖液稀釋，終濃度為約0.2-2 mg/ml ο
[0056]2)純化的羊抗鼠IgG溶于0.1M磷酸鹽緩沖液中，濃度為2.0 mg/ml ；
[0057]3)硝酸纖維素膜大小:10cmX 27cm，每張膜可噴長25 cm的檢測及控制帶各4條；
[0058]4)將以上三種溶液分別加入B1dot點膜儀的三個噴頭儲存瓶中；
[0059]5)設置噴速為2μ1/αιι，Ν(:膜的移行速度為50mm/s。以副溶血弧菌單抗(2 mg/ml)在NC膜上包被反應檢測線Tl，以單無乳鏈球菌單抗(2 mg/ml)在NC膜上包被反應檢測線T2，以1.0 mg/ml兔抗鼠IgG包被反應對照線，對照線與檢測線T1、T2的距離為4一4.5 mm；
[0060]6)完成包被后，置37°C干燥箱24小時，用BB封閉液封閉處理半小時，用WB洗液抽洗一次；
[0061]7)37°C干燥箱干燥備用；
[0062]8)切制備好的硝酸纖維素膜:1.8cm X 27cm/條，放入鋁薄袋中密封干燥保存。置室溫保存備用。
[0063]5.膜反應體系膠體金墊的制備
[0064]I)取膠體金-單抗復合物加稀釋液，混勻配成工作濃度；
[0065]2)將溶液加入噴涂機B1dot的Air jet噴頭儲存瓶中；
[0066]3)設定壓力為15PSI，玻璃纖維膜的移動速度為50mm/s;
[0067]4)噴制規格為0.5-1.5cm X 25cm/條，每條噴2遍；
[0068]5)于37°C烘干12小時，放入鋁薄袋中，加入干燥劑，熱合封口，室溫保存。
[0069]使用時，將試劑條放入相應的塑料卡的固定卡槽中固定，試劑條的樣本墊區域對應加樣孔位置，試劑條質控C線1、檢測T線2-1和2-2區域對應觀察窗口位置，將樣本滴入加樣孔中，在毛細管作用下，向上層析，經過樣本墊M2 4、樣本墊M3 5兩層樣本墊。
[0070]樣本中的特異性檢測目標物與膠體金墊6中的金顆粒-特異性抗體復合物結合，形成金顆粒-抗體-特異性檢測目標物復合物。
[0071]為了增強膠體金墊6的吸附能力，膠體金墊6材料優選采用吸附力較強的無紡布。
[0072]樣本繼續向上層析，通過箭頭指示膠7，與預先包被在硝酸纖維素膜8上的抗副溶血弧菌特異性抗體結合，形成金顆粒-抗體-副溶血弧菌抗原-抗體復合物，金顆粒聚集在硝酸纖維素膜8檢測區，形成檢測T線2-1和2-2，繼續向上層析，與預先包被在硝酸纖維素膜8上的多抗體結合，形成質控C線I，在配合使用的塑料卡的觀察窗口中通過觀察質控C線1、檢測T線2-1和2-2顯色，來判定檢測結果。
[0073]剩余樣本繼續向上層析，被吸收墊9吸收。
[0074]為了增強吸收墊的吸收剩余樣本的能力，吸收墊9材料優選采用高吸水性吸水紙材料。
[0075]以上所述實施例，對本實用新型的目的、技術方案和有益效果進行了進一步的詳細說明，所應理解的是，以上所述僅為本實用新型的具體實施例，并不用于限制本實用新型，凡在本實用新型的精神和原則之內，對本實用新型的修改或替換，均應在本實用新型的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種副溶血弧菌一無乳鏈球菌聯合快速檢測試劑條，包括塑料基板(3)、吸收墊(9)、硝酸纖維素膜(8)、膠體金墊(6)和樣本墊各層狀結構，所述吸收墊(9)固定在塑料基板(3)的上端部，硝酸纖維素膜(8)固定在吸收墊(9)的下部、塑料基板(3)的中間部分，其特征在于:硝酸纖維素膜(8)分為質控區和檢測區，質控區設有質控C線(1)，檢測區設有檢測Tl線(2-1)、檢測T2線(2-2)，質控C線(I)上包被羊抗鼠多抗，檢測Tl線(2-1)上包被有副溶血弧菌抗體，檢測T2線(2-2)上包被有無乳鏈球菌抗體;所述樣本墊包括樣本墊M2、M3兩層結構；膠體金墊(6)固定在塑料基板(3)的下端部、硝酸纖維素膜(8)下部，與硝酸纖維素膜(8)緊靠但不重疊;樣本墊M2(4)位于膠體金墊(6)外層中下部，下端部長于膠體金墊(6)至塑料基板(3)下端;樣本墊M3(5)位于樣本墊M2(4)的外層，箭頭指示膠(7)下端位于樣本墊M3(5)夕卜層、并且一直到達塑料基板(3)最下端，其上端黏附于硝酸纖維素膜(8)的下端。2.根據權利要求1所述的副溶血弧菌一無乳鏈球菌聯合快速檢測試劑條，其特征在于:樣本墊M2 (4)上端與膠體金墊(6)平齊，下端長于膠體金墊(6)但略短于塑料基板(3)下端，樣本墊M3(5)上端距離膠體金墊(6)上端0.5-lcm，樣本墊M3(5)下端與塑料基板(3)下端平齊。3.根據權利要求1所述的副溶血弧菌一無乳鏈球菌聯合快速檢測試劑條，其特征在于:所述硝酸纖維素膜(8)為高蛋白親和性的高分子纖維素膜。4.根據權利要求1所述的副溶血弧菌一無乳鏈球菌聯合快速檢測試劑條，其特征在于:所述膠體金墊(6)為無紡布。5.根據權利要求1所述的副溶血弧菌一無乳鏈球菌聯合快速檢測試劑條，其特征在于:所述樣本墊為無紡布或玻璃纖維。6.根據權利要求1所述的副溶血弧菌一無乳鏈球菌聯合快速檢測試劑條，其特征在于:所述吸收墊(9 )為高吸水性吸水紙。7.根據權利要求1-6其中任一項權利要求所述的副溶血弧菌一無乳鏈球菌聯合快速檢測試劑條，其特征在于:所述塑料基板(3)、吸收墊(9)、硝酸纖維素膜(8)、膠體金墊(6)和樣本墊M2、M3各層狀結構之間通過雙面膠帶固定。
【專利摘要】本實用新型提供一種副溶血弧菌—無乳鏈球菌聯合快速檢測試劑條，包括塑料基板、吸收墊、硝酸纖維素膜、膠體金墊和樣本墊各層狀結構，所述吸收墊固定在塑料基板的上端部，硝酸纖維素膜固定在吸收墊的下部、塑料基板的中間部分，其特征在于：硝酸纖維素膜分為質控區和檢測區，質控區設有質控C線，檢測區設有檢測T1線、檢測T2線，質控C線上包被羊抗鼠多抗，檢測T1線上包被有副溶血弧菌抗體，檢測T2線上包被有無乳鏈球菌抗體；所述樣本墊包括樣本墊M2、M3兩層結構，本實用新型提供的副溶血弧菌--無乳鏈球菌聯合快速檢測試劑條樣本墊為兩層，提高了試劑條的層析速度，縮短反應時間，可一次操作實現副溶血弧菌—無乳鏈球菌兩種細菌的快速檢測。
【IPC分類】G01N33/569
【公開號】CN205246667
【申請號】CN201520962164
【發明人】鄭建, 張君, 劉奇, 黃藝丹
【申請人】濟南康博生物技術有限公司
【公開日】2016年5月18日
【申請日】2015年11月26日