免疫測定待測組分的方法
【專利說明】
[00011 本申請為國際申請PCT/JP2007/071344于2009年6月25日進入中國國家階段、申請 號為200780048145.7、發明名稱為"免疫測定待測組分的方法"的分案申請。
技術領域
[0002] 本發明涉及免疫測定含有血紅蛋白，免疫測定試劑的樣品中的待測組分的方法， 以及抑制血紅蛋白在免疫測定方法中的干擾的方法。
【背景技術】
[0003] 在免疫測定血液中的存在于血細胞，如紅細胞和白細胞外的待測組分的方法中， 將通過從全血中除去血細胞而制得的血清或血漿用作樣品。然而，由于血細胞的去除需要 特殊設備，如離心機，并且比較麻煩，因此已經有建議用全血作為樣品的測定方法(見專利 文獻1)。當用全血作為樣品時，存在著測量受到樣品中因溶血而污染的血細胞組分，如血紅 蛋白或血細胞膜組分干擾的問題。這些組分影響光學檢測系統，抑制免疫反應，并且還吸附 待測物質。現在已有一些關于用全血作為樣品進行免疫測定的方法的報道，這些方法未伴 有溶血避免了這些問題(見專利文獻2，3，4和5)。
[0004] 當測量血細胞中的組成，如細胞內的蛋白質時，必須將血細胞溶解，因此不能使用 沒有伴有溶血的上述方法。在這種情況下，使用的方法包括用流式細胞術分離感興趣的血 細胞，然后將分離出的細胞溶解，并測量血細胞中的預期組分，但這些方法需要特殊設備進 行流式細胞術，并且比較麻煩。
[0005] 另一方面，作為測量細胞內蛋白質的便利方法的例子，將用表面活性劑制備的全 血中的血細胞溶解物作為測量樣品免疫測定MxA蛋白的方法已有報道(非專利文獻1和2)。
[0006] [專利文獻1]日本專利申請特開平No.(jp-A)H1〇-48214(未審查，公開的日本專利 申請）
[0007] [專利文獻 2]JP-A(特開平)H06-265554
[0008] [專利文獻3]W0 96/04558
[0009] [專利文獻4]W0 〇2/732〇3
[0010] [專利文獻 5] JP-A(特開平）2004-45395
[0011] [非專利文獻 1 ] Journal of Interferon Research，（USA)，1992，Vol · 12，No · 2， p.67-74
[0012] [非專利文獻2]Pediatric Research，（USA)，1997，Vol · 41，No · 5，p · 647-650
【發明內容】
[0013][本發明要解決的問題]
[0014]本發明的目的是提供免疫測定含血紅蛋白樣品中的待測組分，以抑制血紅蛋白干 擾的方法和試劑，以及在免疫測定含血紅蛋白樣品中的待測組分的方法中抑制血紅蛋白干 擾的方法。
[0015][解決問題的手段]
[0016] 本發明的發明人發現，在免疫測定樣品中的待測組分的方法中，所述組分可以通 過在膽汁酸衍生物存在下與能與所述組分結合的抗體反應而精確測量，所述膽汁酸衍生物 不同于所述樣品中所固有的膽汁酸衍生物，因此完成了本發明。更具體地，本發明涉及以下
[0017] [1]免疫測定含血紅蛋白樣品中的待測組分的方法，其包括在與所述樣品中所固 有的膽汁酸衍生物不同的膽汁酸衍生物存在下使待測組分與能結合所述組分的抗體反應。
[0018] [2]根據[1]的方法，其包括使含血紅蛋白樣品中的待測組分進一步在聚氧乙烯非 離子型表面活性劑存在下與能結合所述組分的抗體反應。
[0019 ] [ 3 ]根據[1 ]或[2 ]的方法，其中免疫測定的方法是夾心法或競爭法。
[0020] [4]根據[1]或[2]的方法，其中使組分與能結合所述組分的抗體反應是：
[0021] (1)使所述組分與能結合所述組分的第一抗體和能結合所述組分的標記第二抗體 反應，
[0022] (2)使所述組分與標記競爭性物質和既能結合所述組分又能結合所述競爭性物質 的抗體反應，或
[0023] (3)使所述組分與競爭性物質和既能結合所述組分又能結合所述競爭性物質的標 記抗體反應。
[0024] [5]根據[1]_[4]任一項的方法，其中不同于樣品中所固有的膽汁酸衍生物的膽汁 酸衍生物是具有兩性表面活性劑功能的膽汁酸衍生物。
[0025] [6][1]_[4]任一項的方法，其中不同于樣品中所固有的膽汁酸衍生物的膽汁酸衍 生物是具有非離子型表面活性劑功能的膽汁酸衍生物。
[0026] [7][5]的方法，其中具有兩性表面活性劑功能的膽汁酸衍生物是3_[(3_膽酰胺丙 基)二甲銨]丙磺酸鹽（以下簡稱為CHAPS)或3_[ (3-膽酰胺丙基)二甲銨]-2-羥基丙磺酸鹽 (以下簡稱為CHAPS0)。
[0027] [8]根據[6]的方法，其中具有非離子型表面活性劑功能的膽汁酸衍生物是N，N_雙 (3-D-葡糖酰胺丙基)膽酰胺（以下簡稱為BIGCHAP)或N，N-雙(3-D-葡糖酰胺丙基)脫氧膽酰 胺（以下簡稱為脫氧-BIGCHAP)。
[0028] [9]根據[2]_[8]任一項的方法，其中聚氧乙烯非離子型表面活性劑是聚氧乙烯烷 基苯基醚。
[0029] [10]根據[1]-[9]任一項的方法，其中樣品是全血。
[0030] [11]根據[1]-[10]任一項的方法，其中待測組分是MxA蛋白。
[0031] [12]含血紅蛋白樣品中的待測組分的免疫測定試劑，其包括膽汁酸衍生物和選自 以下（1)-(3)的組分：
[0032] (1)能結合所述組分的第一抗體和能結合所述組分的標記第二抗體；
[0033] (2)標記競爭性物質和既能結合所述組分又能結合所述競爭性物質的抗體;以及
[0034] (3)競爭性物質和既能結合所述組分又能結合所述競爭性物質的標記抗體。
[0035] [13]根據[12]的試劑，還包括聚氧乙烯非離子型表面活性劑。
[0036] [14]根據[12]或[13]的試劑，其中膽汁酸衍生物是具有兩性表面活性劑功能的膽 汁酸衍生物。
[0037] [15]根據[12]或[13]的試劑，其中膽汁酸衍生物是具有非離子型表面活性劑功能 的膽汁酸衍生物。
[0038] [16]根據[14]的試劑，其中具有兩性表面活性劑功能的膽汁酸衍生物是CHAPS或 CHAPS0〇
[0039] [17]根據[15]的試劑，其中具有非離子型表面活性劑功能的膽汁酸衍生物是 BIGCHAP 或脫氧-BIGCHAP。
[0040] [18]根據[13]-[17]任一項的試劑，其中聚氧乙烯非離子型表面活性劑是聚氧乙 稀烷基苯基釀。
[0041] [19]在免疫測定含血紅蛋白樣品中的待測組分中抑制血紅蛋白干擾的方法，其包 括在不同于樣品中所固有的膽汁酸衍生物的膽汁酸衍生物存在下使含血紅蛋白樣品中的 待測組分與能結合所述組分的抗體反應。
[0042] [20]根據[19]的方法，其中不同于樣品中所固有的膽汁酸衍生物的膽汁酸衍生物 是具有兩性表面活性劑功能的膽汁酸衍生物。
[0043] [21]根據[19]的方法，其中不同于樣品中所固有的膽汁酸衍生物的膽汁酸衍生物 是具有非離子型表面活性劑功能的膽汁酸衍生物。
[0044] [22]根據[20]的方法，其中具有兩性表面活性劑功能的膽汁酸衍生物是CHAPS或 CHAPS0〇
[0045] [23]根據[21]的方法，其中具有非離子型表面活性劑功能的膽汁酸衍生物是 BIGCHAP 或脫氧-BIGCHAP。
[0046] [24]根據[19]-[23]任一項的方法，其包括使含血紅蛋白樣品中的待測組分進一 步在聚氧乙烯非離子型表面活性劑存在下與能結合所述組分的抗體反應。
[0047][本發明的效果]
[0048]本發明提供了使含血紅蛋白樣品中的待測組分能得以準確測量的免疫測定方法 及用于該方法的試劑，還提供了在免疫測定含血紅蛋白樣品中的待測組分的方法中抑制血 紅蛋白干擾的方法。
[0049]本發明的最佳實施方式
[0050] (1)含血紅蛋白的樣品
[0051] 本發明的免疫測定方法中使用的含血紅蛋白樣品的例子包括含有血紅蛋白的樣 品和懷疑含有血紅蛋白的樣品。含有血紅蛋白的樣品和懷疑含有血紅蛋白的樣品的例子包 括全血，由全血制備的含紅細胞的血細胞級分，懷疑溶血的血漿或血清，紅細胞和添加了血 紅蛋白的任意樣品。關于全血，可以使用采集自受試者的血液本身和已處理的血液，優選已 處理的血液。這樣處理的例子包括抗凝處理和溶血處理，這些處理可以組合使用。
[0052] 在待測組分為血細胞的胞內組分的情況下，全血優選為經溶血處理的血液，尤其 優選為經抗凝和溶血兩種處理的血液。抗凝處理的例子包括向采集的血液中加入EDTA，肝 素等的處理。溶血處理的例子包括加入表面活性劑或皂苷溶液，與低滲溶液混合，凍融和超 聲。
[0053] (2)待測組分
[0054]本發明中的待測組分不受特別限制，只要其是可能含有血紅蛋白的樣品中的組分 即可，組分的例子包括核酸，蛋白質，脂質，維生素和多糖。核酸的例子包括DNA，RNA，ATP， ADP，AMP和cAMP。蛋白質的例子包括酶，激素和各種類型的肽。
[0055]本發明中的優選組分包括細胞內含有的物質和細胞內由各種細胞因子，如干擾素 誘導產生的蛋白質。
[0056]組分的具體例子是細胞質內由I-型干擾素誘導產生的MxA蛋白（Mol.Cell.Biol.， 9,5062-5072,1989；J.Virol.64,1171-1181,1990)〇
[0057] (3)膽汁酸衍生物
[0058] 本發明中的膽汁酸衍生物是與樣品中所固有的膽汁酸衍生物不同的膽汁酸衍生 物。與樣品中所固有的膽汁酸衍生物不同的膽汁酸衍生物不受特別限制，只要其是能促成 本發明的免疫測定方法和抑制血紅蛋白干擾的方法的膽汁酸衍生物即可，優選為具有兩性 表面活性劑功能或非離子型表面活性劑功能的膽汁酸衍生物。
[0059] 具有兩性表面活性劑功能的膽汁酸衍生物的例子包括3_[(3_膽酰胺丙基）二甲 銨]丙磺酸鹽（以下簡稱為CHAPS)和3_[(3_膽酰胺丙基)二甲銨]-2-羥基丙磺酸鹽（以下簡 稱為 CHAPS0)。
[0060] 具有非離子型表面活性劑功能的膽汁酸衍生物的例子包括N，N_雙(3-D-葡糖酰胺 丙基)膽酰胺（以下簡稱為BIGCHAP)和N，N-雙(3-D-葡糖酰胺丙基)脫氧膽酰胺（以下簡稱為 脫氧-BIGCHAP)。
[0061] 膽汁酸衍生物顯示出抑制血紅蛋白在待測組分與能結合該組分的抗體的反應中 的干擾的效果，尤其是，優選使用CHAPS，CHAPSO，BIGCHAP和脫氧-BIGCHAP。
[0062] 膽汁酸衍生物以臨界膠束濃度（cmc)的1至50倍的濃度范圍使用，尤其優選cmc濃 度的1至10倍。在本發明中，膽汁酸衍生物可以單獨使用（一種類型），或者可以兩種或兩種 以上類型的膽汁酸衍生物組合的形式使用。
[0063] (4)聚氧乙烯非離子型表面活性劑
[0064] 聚氧乙烯非離子型表面活性劑在本發明的免疫測定方法中起增強測量靈敏度的 作用，其優選在免疫反應期間存在。
[0065]本發明中的聚氧乙烯非離子型表面活性劑的例子包括聚氧乙烯烷基苯基醚，聚氧 乙稀烷基釀和聚氧乙稀脫水山梨糖醇脂肪酸醋，優選聚氧乙稀烷基苯基釀。聚氧乙稀烷基 苯基醚中的烷基的例子包括辛基和壬基。聚氧乙烯烷基苯基醚的具體例子(市場上可以買 到的產品）是Nonidet P-40(聚氧乙稀壬基苯基醚）。
[0066]在本發明中，聚氧乙烯非離子型表面活性劑可以單獨使用（一種類型），或者可以 兩種或兩種以上類型的聚氧乙烯非離子型表面活性劑組合的形式使用。在本發明的免疫測 定方法中，聚氧乙烯非離子型表面活性劑的濃度優選為0.01 %_2.0%，更優選0.05%-1.8%，尤其優選0.1%-1.4%。
[0067] (5)抗體和標記抗體
[0068] 本發明的免疫測定方法中所使用的抗體不受特殊限制，只要其為特異性結合待測 組分的抗體即可;并且，可以使用多克隆抗體或單克隆抗體，但優選單克隆抗體。此外，本發 明中使用的抗體包括抗體片段。具體例子包括除去了 Fc部分的抗體片段，如通過將抗體用 木瓜蛋白酶處理后得到的Fab，通過胃蛋白酶處理得到的F(ab '）2和通過胃蛋白酶處理及還 原處理得到的Fab '。尤其是，優選抗體片段為F(ab '）2。
[0069] 本發明中所使用的抗體可以通過標準方法用待測組分或其部分作為抗原獲得，也 可以使