一種基于兩親性七肽修飾的表面等離子共振儀芯片的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種基于兩親性七肽修飾的表面等離子共振儀芯片的制備方法，屬于 表面等離子共振譜儀抗污染芯片的設計和制備方法。
【背景技術】
[0002] 表面等離子共振(Surface Plasmon Resonance,簡稱SPR)儀是20世紀80年代出現 的一種生物傳感器技術，當入射光從高折射率介質入射到低折射率介質時，會發生全反射， 此時若在介質交界面處鍍一層金屬薄膜(金或銀），入射光產生的漸逝波會引起金屬表面自 由電子發生集體振蕩，進而形成等離子體，當漸逝波與表面等離子體振蕩的頻率和波數相 等時，即產生共振現象(SPR)，導致能量從漸逝波轉移到表面等離子波中，使反射光的強度 大大減弱，呈現衰減全反射現象，當反射光的強度為零時的入射角稱為共振角。共振角與金 屬薄膜界面介質折射率有關，而折射率又隨結合在金屬薄膜表面的分子質量而變化，故可 通過分析共振角來獲得分子間相互作用的信息，由于其具有檢測快速且無需標記等特點， 已被廣泛應用于蛋白質組學、藥物研發、臨床診斷、食品安全和環境監測等領域，并且顯示 出廣闊的應用前景。
[0003] SPR芯片是表面等離子共振儀最為核心的組件，提供產生SPR信號的必須物理條 件，主要包括耦合器件、金屬膜和表面基質。然而，應用表面等離子共振儀進行分析測試時， 傳感芯片的表面污染是一個普遍存在的問題，來自樣品中的生物分子或微生物的非特異性 吸附將降低定量檢測的準確性，產生假陽性結果。因此，開發有效抵抗非特異性吸附的表面 是提高表面等離子共振傳感器靈敏度和精確度的首要問題。
【發明內容】
[0004] 本發明目的在于提供一種基于兩親性七肽修飾的表面等離子共振儀芯片的制備 方法。該芯片制備方法簡便且具有很好的抗蛋白能力。
[0005] 本發明是通過以下技術方案加以實現的。一種基于兩親性七肽CYSYSYS的表面等 離子共振儀芯片的制備方法：
[0006] -種基于兩親性七肽修飾的表面等離子共振儀芯片抗污染表面制作方法，其特征 是:用十二水合磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀配制pH=7.4的10mM磷酸鹽緩沖液;用磷酸鹽緩沖 液配制濃度為1-lOmg/mL的兩親性七肽CYSYSYS溶液;將清洗干凈的SPR芯片浸入上述兩親 性七肽溶液中，常溫下浸泡5-24h后取出；用乙醇和去離子清洗使芯片表面清洗潔凈，并用 氮氣吹干即可。
[0007] SPR裸金芯片為在基底上涂覆一層鉻層和一層金膜或銀/金復合膜。
[0008] SPR芯片清洗方法是:將芯片浸入體積比為7:3的98 %濃硫酸與30 %雙氧水混合溶 液中，常溫下浸泡2h;然后取出用去離子水清洗多次，用氮氣吹干。
[0009] 磷酸鹽緩沖液進行預先脫氣處理。
[0010] 基底為玻璃片、光纖。
[0011] 兩親性七肽由末端為半胱氨酸（C)、酪氨酸（Y)和絲氨酸（S)交替組成（簡寫為 CYSYSYS)。通過半胱氨酸上的巰基連接到金膜表面，形成自組裝單分子層，從而獲得一種基 于兩親性七肽修飾的表面等離子共振儀芯片。本發明的芯片在單一蛋白（牛血清蛋白、溶菌 酶、β-乳球蛋白），稀釋的復雜體系（lrng/rnL蛋白濃度的血清、豆漿、牛奶)均具有優良的抗污 染性能。本發明的芯片具有優良的抗污染性能，且制備方法簡便，原料易于合成與調控，有 很好的可行性和實用性。
[0012] 本發明的有益效果
[0013] 1)本發明研制的基于兩親性七肽CYSYSYS SPR芯片具有很好的抗污染性能，在溶 菌酶、牛血清蛋白、β-乳球蛋白中非特性吸附量分別為11.78ng/cm2、7.75ng/cm 2、11.6 lng/ cm2,見附圖2。在lmg/mL蛋白濃度的血清、豆漿、牛奶稀釋液中非特異性吸附量分別為 106.1 lng/cm2、189.1 lng/cm2、228.86ng/cm2，見附圖3，遠低于各蛋白在SPR裸金芯片表面的 非特異性吸附量，見附表1。
[0014] 2)本發明研制的基于兩親性七肽CYSYSYS SPR芯片具有生物功能化作用，如可通 過固載牛血清蛋白抗體進而檢測其抗原。
[0015] 3)本發明研制的基于兩親性七肽CYSYSYS SPR芯片具有高穩定性，干燥狀態下儲 存3個月或pH為7.4磷酸鹽緩沖液中儲存7天后，抗污染性能無變化。
[0016] 4)本發明研制的基于兩親性七肽CYSYSYS SPR芯片的制備方法簡便快速，解決了 以往多步繁瑣的制備過程，極大地提高了芯片表面修飾的效率。
[0017] 5)本發明研制的基于兩親性七肽CYSYSYS作為SPR芯片表面的抗污染材料具有生 物可降解性。
【附圖說明】
[0018] 圖1基于兩親性七肽CYSYSYS修飾的SPR芯片;其中，1-玻璃片基底，2-鉻層，3-金膜 層，4-兩親性七肽CYSYSYS自組裝單分子層。
[0019] 圖2兩親性七肽CYSYSYS SPR芯片對lmg/mL的溶菌酶（Lysozyme)、牛血清蛋白 (BSA)、溶液中蛋白的非特異性吸附量。
[0020] 圖3兩親性七肽CYSYSYS SPR芯片對lmg/mL蛋白濃度的中蛋白的非特異性吸附量。
【具體實施方式】 [0021] 實施例1
[0022]具體操作方法如下：
[0023] 1)裸金芯片制備
[0024]如附圖1所示，采用電子束蒸發鍍膜技術在BK7玻璃基底（1)上涂覆一層2-3nm厚鉻 層(2)和一層45-50nm厚金膜(3)，獲得了裸金芯片。
[0025] 2)裸金芯片預處理
[0026] 將步驟1)獲得的裸金芯片浸入98 %濃硫酸與30 %雙氧水(體積比7 : 3)混合溶液 中，常溫下浸泡2h。然后取出用去離子水清洗3次，用氮氣吹干備用。
[0027] 3)兩親性七肽CYSYSYS修飾
[0028]用十二水合磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀配制pH = 7.4的lOmM磷酸鹽緩沖液。用預先 脫氣的磷酸鹽緩沖液配制濃度為lmg/mL的兩親性七肽CYSYSYS(上海吉爾生化公司合成)溶 液。將步驟2)獲得的芯片浸入上述兩親性七肽溶液中，常溫下浸泡12h后取出。用乙醇和去 離子水依次清洗3次，并用氮氣吹干備用，即獲得兩親性七肽；如附圖1中的兩親性七肽 CYSYSYS層(4)所示的修飾的SPR芯片。
[0029]兩親性七肽SPR芯片表面蛋白吸附量檢測
[0030]將獲得的兩親性七肽CYSYSYS修飾的SPR芯片用柏油貼合到SPR系統的棱鏡上。以 pH為7.4的磷酸緩沖液為流動相，流速為1(^1711^11。待基線平穩后，往定量環中注入10(^ Llmg/mL的牛血清白蛋白或溶菌酶或β-乳球蛋白或lmg/mL蛋白濃度的血清、豆漿、牛奶稀釋 液，經流動相推動蛋白溶液到達芯片表面，由SPR系統測定共振角實時變化曲線，20min后讀 取SPR共振角變化值，并計算非特異性吸附量。
[0031] 實施例2
[0032]具體操作方法如下：
[0033] 1)裸金芯片制備
[0034]如附圖1所示，采用電子束蒸發鍍膜技術在BK7玻璃基底（1)上涂覆一層2-3nm厚鉻 層(2)和一層45-50nm厚金膜(3)，獲得了裸金芯片。
[0035] 2)裸金芯片預處理
[0036] 將步驟1)獲得的裸金芯片浸入98 %濃硫酸與30 %雙氧水（體積比7 : 3)混合溶液 中，常溫下浸泡2h。然后取出用去離子水清洗3次，用氮氣吹干備用。
[0037] 3)兩親