一種蛋白質快速檢測試劑盒及其檢測方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物化學檢測的技術領域，具體設及一種蛋白質快速檢測試劑盒及其 檢測方法和應用。
【背景技術】
[0002] 蛋白質是一切生命的物質基礎，是人體組織更新和修補的主要原料，蛋白質與各 種形式的生命活動緊密的聯系在一起，具有極其重要的生理學意義。同時，蛋白質又是重要 的營養素之一，食物中的蛋白質是人體攝入氮的唯一來源，具有其他營養物質不可替代的 作用。近些年來，食物中蛋白質滲雜滲假事件時有發生，對人體造成極了嚴重的傷害，所W， 建立快速、準確、操作簡單的蛋白質檢測方法已迫在眉睫。
[0003] 目前，食品蛋白質檢測的權威方法是凱氏定氮法，該方法也是食品蛋白質檢測的 國家標準方法(GB5009.5)，但是該方法操作繁瑣，時間長(4-8小時），并且反應過程中會產 生大量的有毒氣體，不利于環境安全，對操作環境、設備W及操作人員的技能要求較高。在 生物醫學領域，關于分光光度法測定蛋白質的研究有很多，其中的雙縮脈分光光度法應用 于蛋白質的測定已有近百年的歷史，該法作為我國農業標準(NY/T1678)乳與乳制品中蛋白 質的測定方法，對蛋白質的檢出限為5 X l(T5g/100g。雙縮脈法測定蛋白質的原理是當物質 中含有兩個或者兩個W上膚鍵時會和堿性的硫酸銅溶液發生反應，生成紫色的大分子絡合 物，該產物是膚鍵中的氮原子和銅離子配價結合的結果，其顏色深淺與物質中所含的蛋白 質含量成正比，所W可W根據產物吸光值的變化來測定蛋白質含量。雙縮脈分光光度法具 有操作簡單，重復性好，反應所用試劑單一、穩定，不同種類的蛋白質產物顏色深淺相近，并 且干擾物質少，受溫度影響極小等優點，可W快速地測定蛋白質含量。但是雙縮脈分光光度 法存在一些較為嚴重的缺陷，該方法雖然檢測時間較短（20~30分鐘），但是檢測靈敏度較 差，在測量低蛋白含量的樣品時有一定的困難。
【發明內容】
[0004] 為解決上述蛋白質檢測技術存在不足的技術問題，本發明提供了一種檢測迅速、 檢測靈敏度高的蛋白質快速檢測試劑盒及其制備方法和應用。
[0005] 本發明提供了一種蛋白質快速檢測試劑盒，該檢測試劑盒包括雙縮脈試劑、表面 活性劑和助表面活性劑。
[0006] 優選的，表面活性劑為吐溫60、吐溫80、聚乙二醇辛基苯基酸、十二烷基苯橫酸鋼 中的一種。
[0007] 優選的，助表面活性劑為無水乙醇、正丙醇、正下醇、正己醇、正辛醇、乙二醇、丙二 醇、甘油、聚甘油醋中的一種或兩種W上。
[000引本發明還提供了一種蛋白質快速檢測試劑盒的檢測方法，該檢測方法包括W下步 驟：
[0009] (1)將表面活性劑和助表面活性劑按質量比1-100:1混合均勻，得到混合表面活性 劑;將混合表面活性劑和油相按質量比1-10:1-10混合后，加入去離子充分溶解，制得微乳 液；
[0010] (2)將上述制得的微乳液和雙縮脈試劑按體積比1:1-100混合均勻，得到雙縮脈-微乳體系顯色液；
[0011] (3)在標準蛋白質溶液各梯度樣品和待測樣品中加入上述制得的雙縮脈-微乳體 系顯色液，測定其吸光值，W標準蛋白質溶液各梯度樣品的濃度和吸光值擬合標準曲線，將 待測樣品的吸光值代入標準曲線中計算蛋白質含量。
[0012] 優選的，表面活性劑為吐溫60、吐溫80、聚乙二醇辛基苯基酸、十二烷基苯橫酸鋼 中的一種。
[0013] 優選的，助表面活性劑為無水乙醇、正丙醇、正下醇、正己醇、正辛醇、乙二醇、丙二 醇、甘油、聚甘油醋中的一種或兩種W上。
[0014] 優選的，油相為大豆油、橄攬油、甲酸乙醋、乙酸乙醋、丙酸乙醋、下酸乙醋、甘油Ξ 酸醋、油酸乙醋中的一種或兩種W上。
[001引步驟(2)中雙縮脈試劑包含:5-80g/L的氨氧化鐘或氨氧化鋼、1.0-6.0g/L的硫酸 銅、3-12g/L的酒石酸鐘鋼或乙二胺四乙酸二鋼。
[0016] 本發明還提供了一種蛋白質快速檢測試劑盒的應用，所述檢測試劑盒用于檢測含 蛋白質樣品中的蛋白質含量。
[0017] 本發明的有益效果:本發明在雙縮脈試劑中添加微乳液，微乳液具有增溶、增敏的 特性，使得改進后的雙縮脈法具有靈敏度高、操作簡單、干擾物少、重復性好的優點。該檢測 方法對蛋白質的檢測靈敏度與傳統方法相比提高5-10倍，可W應用于微量蛋白質樣品的檢 巧。，與國標凱氏定氮法比較，其相對誤差在0.28-0.60%之間，本發明的檢測方法具有良好 的精確度與準確度。
【附圖說明】
[0018] 圖1為本發明制備的雙縮脈-微乳體系與傳統雙縮脈溶液的吸收光譜比較，其中A 為雙縮脈-微乳體系的吸收光譜;B為傳統雙縮脈溶液的吸收光譜。
【具體實施方式】
[0019] 下面結合實施例對本發明進行詳細地解釋說明。
[0020] 實施例1
[0021] 采用本發明的檢測試劑盒，配制吐溫80微乳體系-雙縮脈顯色液，進行樣品蛋白質 的測定。
[0022] (1)吐溫80微乳液體系溶液的制備
[0023] ①混合表面活性劑溶液的制備
[0024] 準確稱取0.25g吐溫80非離子表面活性劑和0.25g無水乙醇兩者混合制成混合表 面活性劑。
[0025] ②混合表面活性劑與油相混合溶液的制備
[0026] 選擇下酸乙醋為乳液體系的油相，向上述混合表面活性劑中加入0.05g的下酸乙 醋。
[0027]③混合表面活性劑/油相與水相微乳液體系的制備
[00%]將上述吐溫80、無水乙醇和下酸乙醋的混合液，室溫下攬拌，邊攬拌邊滴加去離子 水，當混合液由渾濁變為澄清透明溶液時停止滴加去離子水。
[0029] (2)雙縮脈試劑的制備
[0030] 稱取硫酸銅（CuS〇4 · 5此0)1.5g和酒石酸鐘鋼化化C4H4O6 · 4此0)6.0g，用500mL蒸 饋水溶解，在攬拌下加300mL質量百分數10%化0H，用水稀釋到lOOOmL，儲存于塑料瓶中（或 內壁涂有石蠟的瓶中），此試劑可長期保存。若儲存瓶中有黑色沉淀出現，則需重新配制。
[0031] (3)雙縮脈-微乳體系顯色液的制備
[0032] 選取上述制備的吐溫80微乳體系溶液和雙縮脈溶液按照體積比1:100配制成吐溫 80微乳體系-雙縮脈顯色液顯色液。
[0033] (4)樣品測定
[0034] 在標準蛋白質溶液各梯度樣品和待測樣品中加入上述制得的雙縮脈-微乳體系顯 色液(每毫升蛋白質樣品中加入4mL的雙縮脈-微乳體系顯色液），測定其吸光值，W標準蛋 白質溶液各梯度樣品的濃度和吸光值擬合標準曲線，將待測樣品的吸光值代入標準曲線中 計算蛋白質含量。稱取酪蛋白溶解于蒸饋水中，配制濃度為2mg/mL的標準蛋白質溶液，將配 制好的標準蛋白質溶液按照二倍稀釋法稀釋成不同濃度，即得標準蛋白質溶液各梯度樣 品。
[0035] 實施例2
[0036] 采用本發明的檢測試劑盒，配制Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基酸，非離子)微 乳體系-雙縮脈顯色液，進行樣品蛋白質的測定。
[0037] (l)Triton X-100微乳液體系溶液的制備 [003引①混合表面活性劑溶液的的制備
[0039] 準確稱取0.75g Triton X-100表面活性劑和0.25g正丙醇兩者混合制成混合表面 活性劑。
[0040] ②混合表面活性劑與油相混合溶液的制備
[0041] 選擇下酸乙醋為微乳液體系的油相，向上述混合表面活性劑中加入O.lg的下酸乙 醋。
[0042] ③混合表面活性劑/油相與水相微乳液體系的制備
[0043] 將上述Triton X-100、正丙醇和下酸乙醋的混合液，室溫下攬拌，邊攬拌邊滴加去 離子水，當混合液由渾濁變為澄清透明溶液時停止滴加去離子水。
[0044] (2)雙縮脈試劑的制備
[0045] 稱取硫酸銅（CuS〇4 · 5H2〇)3.0g，溶于500mL新鮮蒸饋水中，加酒石酸鐘鋼 化NaC4H4〇6 · 4出0)9. Og，艦化鐘化I)5. Og，待完全溶解后，加