入6mol/L氨氧化鋼溶液100血， 最后加蒸饋水至1L。
[0046] (3)雙縮脈-微乳體系顯色液的制備
[0047] 選取上述制備的化iton X-100微乳體系溶液和雙縮脈溶液按照體積比3:11配制 成Triton X-100微乳體系-雙縮脈顯色液顯色液。
[004引（4)樣品測定
[0049]在標準蛋白質溶液各梯度樣品和待測樣品中加入上述制得的雙縮脈-微乳體系顯 色液(每毫升蛋白質樣品中加入4mL的雙縮脈-微乳體系顯色液），測定其吸光值，W標準蛋 白質溶液各梯度樣品的濃度和吸光值擬合標準曲線，將待測樣品的吸光值代入標準曲線中 計算蛋白質含量。稱取酪蛋白溶解于蒸饋水中，配制濃度為2mg/mL的標準蛋白質溶液，將配 制好的標準蛋白質溶液按照二倍稀釋法稀釋成不同濃度，即得標準蛋白質溶液各梯度樣 品。
[00加]實施例3
[0051] 采用本發明的檢測試劑盒，配制微乳體系-雙縮脈顯色液，進行樣品蛋白質的測 定。
[0052] (1)微乳液體系溶液的制備
[0053] ①混合表面活性劑溶液的的制備
[0054] 準確稱取25g SDS(十二烷基苯橫酸鋼)或吐溫60、0.25g正下醇，兩者混合制成混 合表面活性劑。
[0055] ②混合表面活性劑與油相混合溶液的制備
[0056] 選擇下酸乙醋為乳液體系的油相，向上述混合表面活性劑中加入252.5g的下酸乙 醋。
[0057] ③混合表面活性劑/油相與水相微乳液體系的制備
[005引將上述SDS或吐溫60、正下醇、下酸乙醋的混合液，室溫下攬拌，邊攬拌邊滴加去離 子水，當混合液由渾濁變為澄清透明溶液時停止滴加去離子水。
[0059] (2)雙縮脈試劑的制備
[0060] 稱取硫酸銅（CuS〇4 · 5此0)3.8g，乙二胺四乙酸二鋼化DTA-化2 · 2此0)5.7g，甘氨 酸17.5g，氯化鋼14.Og，溶解于750.OmL蒸饋水中后加氨氧化鋼40.Og，并W蒸饋水稀釋至 1L。
[0061] 也可W使用W下方法：
[0062] 稱取硫酸銅（CuS〇4 · 5H2〇)3.0g，溶于500mL新鮮蒸饋水中，加酒石酸鐘鋼 化Na私Η地6 · 4出0)9. Og，艦化鐘化I)5. Og，待完全溶解后，加入6mol/L氨氧化鐘溶液100血， 最后加蒸饋水至1L。
[0063] (3)雙縮脈-微乳體系顯色液的制備
[0064] 選取上述制備的SDS-微乳體系溶液或吐溫60-微乳體系溶液和雙縮脈溶液按照體 積比1:1配制成微乳體系-雙縮脈顯色液。
[0065] (4)樣品測定
[0066] 在標準蛋白質溶液各梯度樣品和待測樣品中加入上述制得的雙縮脈-微乳體系顯 色液(每毫升蛋白質樣品中加入4mL的雙縮脈-微乳體系顯色液），測定其吸光值，W標準蛋 白質溶液各梯度樣品的濃度和吸光值擬合標準曲線，將待測樣品的吸光值代入標準曲線中 計算蛋白質含量。稱取酪蛋白溶解于蒸饋水中，配制濃度為2mg/mL的標準蛋白質溶液，將配 制好的標準蛋白質溶液按照二倍稀釋法稀釋成不同濃度，即得標準蛋白質溶液各梯度樣 品。
[0067] 對比實施例1
[0068] 分別采用國標凱氏定氮法、雙縮脈法、本發明的微乳體系-雙縮脈法對A、B、C、D、E 五種樣品進行測定，每種樣品重復測定5次，分別計算蛋白質含量(g/lOOg)，取5次平均值， 對測量結果進行比較，并根據測試結果對本發明的檢測方法進行τ檢驗(雙尾)和方差分析。
[0069] 實驗結果如表1所示，結果表明：微乳體系-雙縮脈法(本發明的方法)測定蛋白含 量與凱氏定氮法測定的蛋白質值比較，相對誤差在0.28-0.60 %范圍內；標準雙縮脈法測定 蛋白質含量與凱氏定氮法測定的蛋白質相比，相對誤差在0.74-1.31 %范圍內。微乳體系-雙縮脈分光光度法的相對誤差遠小于傳統雙縮脈分光光度法，說明微乳體系-雙縮脈分光 光度法比標準雙縮脈分光光度法測定的蛋白質含量更接近蛋白質的真實含量，可知，該方 法的靈敏度明顯高于標準雙縮脈分光光度法。
[0070] 表1本發明的方法、國標凱氏定氮法、雙縮脈法對樣品測定結果
[0071]
[0072] 對比實施例2
[0073] 采用傳統雙縮脈分光光度法和本發明的微乳體系-雙縮脈分光光度法，在相同條 件下，對同一蛋白樣品進行吸光值的測定，對比其吸收曲線。
[0074] 結果如附圖1所示，結果分析顯示，本發明方法測定的蛋白質的吸光度最大值為 0.30,計算的其表觀摩爾吸光系數為7.5X 105L/mol · cm,而傳統的雙縮脈分光光度法測定 蛋白質的吸光度最大值為0.105，計算的表觀摩爾吸光系數為1.22X 105L/mol·cm，所W， 本發明的方法增敏作用顯著，同等條件下，靈敏度比普通雙縮脈試劑增加了大約6.15倍。
[0075] 本發明的較佳實施例而已，并不用W限制本發明，凡在本發明實質內容上所作的 任何修改、等同替換和簡單改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種蛋白質快速檢測試劑盒，其特征在于，該檢測試劑盒包括雙縮脲試劑、表面活性 劑和助表面活性劑。2. 根據權利要求1所述的蛋白質快速檢測試劑盒，其特征在于，表面活性劑為吐溫60、 吐溫80、聚乙二醇辛基苯基醚、十二烷基苯磺酸鈉中的一種。3. 根據權利要求1所述的蛋白質快速檢測試劑盒，其特征在于，助表面活性劑為無水乙 醇、正丙醇、正丁醇、正己醇、正辛醇、乙二醇、丙二醇、甘油、聚甘油酯中的一種或兩種以上。4. 一種蛋白質含量的快速檢測方法，其特征在于，該檢測方法包括以下步驟： (1) 將表面活性劑和助表面活性劑按質量比1-100:1混合均勻，得到混合表面活性劑； 將混合表面活性劑和油相按質量比1-10:1-10混合后，加入去離子充分溶解，制得微乳液； (2) 將上述制得的微乳液和雙縮脲試劑按體積比1:1-100混合均勻，得到雙縮脲-微乳 體系顯色液； (3) 在標準蛋白質溶液各梯度樣品和待測樣品中加入上述制得的雙縮脲-微乳體系顯 色液，測定其吸光值，以標準蛋白質溶液各梯度樣品的濃度和吸光值擬合標準曲線，將待測 樣品的吸光值代入標準曲線中計算蛋白質含量。5. 根據權利要求4所述的蛋白質含量的快速檢測方法，其特征在于，表面活性劑為吐溫 60、吐溫80、聚乙二醇辛基苯基醚、十二烷基苯磺酸鈉中的一種。6. 根據權利要求4所述的蛋白質含量的快速檢測方法，其特征在于，助表面活性劑為無 水乙醇、正丙醇、正丁醇、正己醇、正辛醇、乙二醇、丙二醇、甘油、聚甘油酯中的一種或兩種 以上。7. 根據權利要求4所述的蛋白質含量的快速檢測方法，其特征在于，油相為大豆油、橄 欖油、甲酸乙酯、乙酸乙酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯、甘油三酸酯、油酸乙酯中的一種或兩種以 上。8. 根據權利要求4所述的蛋白質含量的快速檢測方法，其特征在于，步驟(2)中雙縮脲 試劑包含:5-80g/L的氫氧化鉀或氫氧化鈉、1.0-6.Og/L的硫酸銅、3-12g/L的酒石酸鉀鈉或 乙二胺四乙酸二鈉。9. 權利要求1-3任一項所述的蛋白質快速檢測試劑盒的應用，其特征在于，所述檢測試 劑盒用于檢測含蛋白質樣品中的蛋白質含量。
【專利摘要】本發明公開了一種蛋白質快速檢測試劑盒及其檢測方法和應用，該檢測試劑盒包括雙縮脲試劑、表面活性劑和助表面活性劑。本發明的檢測方法通過在雙縮脲試劑中添加表面活性劑和助表面活性劑，使制得的微乳液具有增溶、增敏的特性，使得改進后的雙縮脲法具有靈敏度高、操作簡單、干擾物少、重復性好的優點。該檢測方法對蛋白質的檢測靈敏度與傳統方法相比提高5-10倍，可以應用于微量蛋白質樣品的檢測，與國標凱氏定氮法比較，其相對誤差在0.28-0.60％之間，本發明的檢測方法具有良好的精確度與準確度。
【IPC分類】G01N21/79
【公開號】CN105486682
【申請號】CN201511003463
【發明人】田波, 馬麗華, 田然, 劉平平, 陳晨, 高寶玉, 李野
【申請人】東北農業大學
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2015年12月28日