一種利用同位素稀釋質譜法測量糖化血紅蛋白的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種利用同位素稀釋質譜法測定糖化血紅蛋白的方法，特別涉及一種 利用同位素稀釋液相色譜串聯質譜法準確測量待測樣品中糖化血紅蛋白含量方法。
【背景技術】
[0002] 糖化血紅蛋白（縮寫作hemoglobinAle、化Ak、AlC或化Ale)是血液紅細胞中的 血紅蛋白與葡萄糖結合的產物，可W反映測定前6-8周患者體內平均血糖水平，通常作為 評估糖尿病患者體內血糖控制情況與療效觀察的主要指標，一般來說血紅蛋白被糖基化的 比例與一段時間內體內血糖濃度的水平成正比。對應的，非糖化血紅蛋白用化A0表示。目 前，國際上定義化Ai。化學構成為葡萄糖穩定的連接在血紅蛋白目鏈N末端鄉氨酸（Val) 殘基上，即血紅蛋白（血液）-N-(l-脫氧果糖基）血紅蛋白目鏈（目N-1-deo巧化uctosyl -hemoglobin)。
[0003] 葡萄糖進入紅細胞后與血紅蛋白化A的目鏈N末端鄉氨酸殘基縮合，先形成一 種不穩定的Schiff堿（醒亞胺結構），即前化Ai。，再解離或經Amadori分子重排后形成 化Ai。（醒麗結構），此反應的過程是緩慢和不可逆的，并且由于紅細胞內沒有分解醒麗的 酶，因此化Ai。濃度只與紅細胞壽命和該時期體內血糖的平均濃度有關，不受運動或食物的 影響，反映的是過去6-8周的平均血糖濃度，是目前國際上公認的用于評估糖尿病患者長 期血糖狀況的金標準。
[0004]目前有超過20種不同的方法用于測量化Ai。，其主要的檢測原理主要有如下3種：
[0005] (1)離子交換層析法：它是基于不同組分的電荷差異進行分離的。葡萄糖與化 的目鏈N末端Val連接降低了等電點，導致糖化化帶的正電荷比未糖化化的少，與樹脂 的附著力小，可W分別用不同離子濃度的緩沖液在不同的時間將化從陽離子交換柱中洗 脫下來，再根據每個峰值下的面積來計算化Ai。占總化的比例。但是該方法中化變異體 會隨化Ai。一起洗脫，影響化Ai。值，離子交換層析法受溫度、抑值、抗凝劑和柱效的影響 較大，從而使結果產生偏差。常規的離子交換HPLC法經過多年技術上的改進，檢測精密度 (CVK1%、分辨率及抵抗多種糖化血紅蛋白變異體的能力有了明顯提高，基本可W達到臨 床需求，美國糖化血紅蛋白標準化計劃（NGS巧的參考實驗室也是使用Bi〇-Rex70陽離子交 換樹脂HPLC作為常規實驗標準參考方法，但是非特異性的問題仍然不能完全克服。
[0006] (2)親和層析法；用于分離糖化與非糖化血紅蛋白的親和層析凝膠柱是交聯了間 氨基苯測酸的瓊脂糖珠。測酸具有與整合在血紅蛋白分子上葡萄糖的順位二醇基作可逆結 合反應的性質，致使化Ai。選擇性地結合于柱上，而非糖化血紅蛋白被洗脫，然后變換條件， 又可W將化Ai。重新解離，獲得純化。除葡萄糖外，血液中其他糖類都可與測酸基結合，因此 該方法的檢測結果為G冊總量，而不是化Ai。的含量，該方法不受溫度、G冊變異體的影響， 通過校準，其結果與離子交換法有良好的相關性，已被臨床廣泛采用。但該實驗測定結果受 到除血紅蛋白目鏈N末端鄉氨酸殘基W外糖基化的影響。
[0007] (3)免疫法：利用抗原、抗體反應的原理，使用單克隆或多克隆抗體與血紅蛋白 目-鏈上糖基化的N末端的4-8個氨基酸作為抗體識別位點，發生凝集反應，通過吸光度 來測定凝集量，可用全自動生化分析儀進行檢測。該抗原與IFCC參考系統用于制備一級 參考物質的目鏈N末端6個氨基酸膚端極為相似，其參考范圍（2. 8%~4. 9%)比其他 方法更低，而與IFCC推薦的化85~3. 81 % )更為一致。但是，當化發生第6位氨基酸 變異出bS(目6glu-val)和化C(目6glu-lys)]時將不會被識別，有報道對此變異進行 實驗顯示，廠家間的檢測結果存在著偏倚。2011年，參加衛生部臨床檢驗中必化Ai。項目 的實驗室中，離子交換高效液相色譜和免疫比濁法最為普遍，實驗室所占比例超過45%和 25%，鑒于此，張傳寶等對3個基于高效液相色譜和1個基于免疫比濁法原理的化Ai。測定 系統的精密度和正確度進行驗證，免疫法批內精密度CV為0. 54%~1. 02%，室內精密度 CV為0. 54%~1. 17%;測定標準物質的均值（NGSP值）和標準物質定值的偏倚為-0. 34% HbAic~0. 18%HbAic，與IFCC定值導出的NGSP值的偏倚為-0. 14%HbAic~0. 05%HbAic， 批內精密度和實驗室內精密度及正確度性能均符合相關要求，認為可W滿足臨床工作的需 要，具有廣闊的應用前景。
[000引盡管化A1C標準化測定的問題早在1984年即已提出，但直到1993年DCCT的結 果發布后，才開始受到關注。美國、日本和瑞典等國家都分別建立了化Ai。國家標準綱要， 其中最為"著名"的是NGSP(NationalGlycohemoglobinStandardizationProgram)計 劃。NGSP參考系統是WDCCT數值為基礎，把NGSP參考實驗室網絡中各種實驗方法都校準 為DCCT參考方法，并建議各實驗室只能采用被NGSP認可的方法來檢測化Ai。，使臨床實驗 室的檢測結果與DCCT的檢測結果更具有相關性，大大減少了各實驗室之間的差異。
[0009]NGSP主要內容為；NGSP管理委員會下設由中必參考實驗室、一級參考實驗室 和二級參考實驗室組成的參考實驗室網絡，其主要的職責為；（1)負責參與生產廠家的 儀器校準；（2)負責對實驗室和廠家進行正確度認證；（3)對常規實驗室進行能力驗證 (proficien巧test,PT)。自NGSP計劃建立W來，美國臨床實驗室間化Ai。測定的結果"從 混亂進入有序"狀態，目前參加NGSP活動的實驗室室間CV小于5%，化Ale結果與NGSP革己 值的偏倚小于8%，并且自2005年W后，參加美國病理工作者協會（CollegeofAmerican Pathologists,CA巧化Ai。室間質評的實驗室，95 %W上均經過了NGSP認證，經過CAP和 NGSP兩組織的共同監測，推進了臨床實驗室關于糖化血紅蛋白的檢測質量。
[0010] 1995年，日本糖尿病學會（JapaneseDi油etesSociety,JD巧采用HPLC方法制 備了國家級的校準品（JDSCalibratorlot1)，推薦用于所有的常規糖化血紅蛋白檢測方 法的定標，對化Ai。檢測進行標準化，并且經過幾年的努力，日本臨床化學學會（Japanese SocietyofClinicalQiemistry,JSCC)采用K0500 制備了國家二級校準品（JDS/JSCC Calibratorlot2)，實現了標準物質的溯源性。瑞典臨床化學學會（SwedishSocietyof Clinical化emistry，SFKK)將MonoSHPLC方法作為國家指定參考方法，推薦用于糖化血紅 蛋白的標準化。具體實施內容為；每月一次，將己二胺四己酸巧DTA)抗凝的新鮮全血樣本 發放至40家使用HPLC方法的臨床醫院，其中有5家醫院采用MonoSHPLC參考方法，從而 達到對常規實驗室的能力驗證，并且作為重點關注的檢驗儀器，要求所有的醫院每2年至 少對糖化血紅蛋白儀器進行校準一次。
[0011] 上述國家級參考方法均采用離子交換色譜法，由于受樹脂種類、柱子規格、緩沖液 組分、洗脫時間和色譜分辨率不同等原因的影響，檢測結果也不同，在美國，DCCT和NGSP使 用指定的參比方法，應用Bi〇-Rex70HPLC和瑞典的MonoSHPLC方法檢測化Ai。，在臨界值 仍有20%的差異，顯然在度量學方面，無法滿足參考方法的要求。
[001引國際臨床化學組織（IFCC)建立了化Ai。標準化工作組，旨在研究一個可供追溯的 參照系統，研發化Ai。參考物質和參考方法，該工作組歷時5年的探索，經過多家實驗室的 努力，于2002年推出了一套化Ai。參考方法，即將待測標本溶血后經胞內蛋白酶酶解，然后 應用高效液相色譜串聯電噴霧質譜儀或高效液相色譜串聯毛細管電泳儀，利用信號比例計 算出糖基化的B鏈N末端六膚片段的比例，從而得出化Ai。在樣本中所占的百分比，是檢測 化Ai。分子濃度的新方法。此方法已經由包括歐洲、日本和美國在內的11家IFCC參考實驗 室驗證。IFCC推薦的檢測化Ai。方法的結果與DCCT的結果存在一定差異，其檢測值較NGSP 的化Ai。檢測值低，兩個方法相關系數R為1.000,室內CV為0.47%~2. 07%，室間CV為 1. 35 %~2. 27%。但是IFCC推薦的檢測化Ai。方法，實驗操作比較復雜，耗時較長，儀器昂 貴、維護和保養成本較高，目前仍只限于糖化血紅蛋白標準化的研究。
[0013] 由于我國目前化Ai。測定的方法、實驗價格、地區醫療水平的差異等原因，化Ai。的 測定并未普及，化Ai。作為糖尿病診斷指標也存在亟須解決問題，主要是我國化Ai。檢測方法 的標準化程度不夠，測定的儀器和質量控制尚不能符合目前糖尿病診斷標準的要求，因此 目前暫不推薦應用化Ai。診斷糖尿病，但是為提高我國糖尿病的診斷、治療、管理水平，2010 年3月，中國化Ai。教育計劃在京啟動，該計劃是國內首次由內分泌和檢驗界專家共同參與 的大型學術活動，旨在提高化Ai。在糖尿病管理中的重要地位，加強臨床醫生對化Ai。的認識 和重視。
[0014] 我國化Ai。測定標準化工作起步較晚，目前仍處于初級階段，但是國內的檢驗界學 者越來越重視糖化血紅蛋白測定的量值溯源及標準化問題。衛生部臨床檢驗中必王冬環等 建立了高效液相色譜串聯電噴霧質譜法準確測量糖化血紅蛋白的參考方法（不同濃度血 樣及國際標準物質批內變異系數CV平均為0. 70 %，總CV為0. 85 %，測定國際標準物質，測 定值與認定值的偏差為-0. 8%~0. 25%，并研制了基于質譜方法的糖化血紅蛋白國家一 級標準物質（GBW09181、GBW09182、GBW09183)，送為HbAi。的準確測量和量值溯源提供了有 力的物質保障。
【發明內容】
[0015] 本發明的目的是提供一種同位素稀釋液相色譜串聯質譜法在檢測糖化血紅蛋白 中的應用，W及具體的利用同位素稀釋液相色譜串聯質譜法檢測待測樣品中糖化血紅蛋白 含量的方法。
[0016] 本發明所提供的利用同位素稀釋液相色譜串聯質譜法檢測待測樣品中糖化血紅 蛋白含量的方法，是在國際臨床化學組織（IFCC)推薦的檢測方法（參見"ApprovedIFCC referencemethodforthemeasurementofHbAlcinhuma