先前活的物體的物質。這類活物 包括但不限人、小鼠、猴、大鼠、兔和其他動物。在一個實施方案中，樣品從猴、尤其食蟹猴、 或兔、或小鼠或大鼠獲得。在一個實施方案中，這類物質包括但不限于來自個體的全血、血 清或血漿，這些是臨床日常工作中最廣泛使用的樣品來源。
[0095] 術語"固相"指非流體物質，并且包括由多種材料如聚合物、金屬（順磁性、鐵磁性 顆粒）、玻璃和陶瓷制成的顆粒（包括微顆粒和珠）；膠狀物質如二氧化硅、氧化鋁和聚合 物凝膠；可以由聚合物、金屬、玻璃、和/或陶瓷構成的毛細管；沸石和其他多孔物質；電極； 微量滴定板；固態條；和比色皿、管或其他分光儀樣品容器。固相組分與惰性固體表面的區 別在于，"固相"在其表面上含有意在與樣品中物質相互作用的至少一種部分。固相可以是 固定組分，如管、條、比色皿或微量滴定板，或可以是非固定組分，如珠和微顆粒。可以使用 允許蛋白質和其他物質的非共價或共價附著的多種微顆粒。這類顆粒包括聚合物顆粒如聚 苯乙烯和聚（甲基丙烯酸甲酯）；金顆粒如金納米顆粒和金膠體；和陶瓷顆粒如石英、玻璃， 和金屬氧化物顆粒。參見例如Martin,C.R.等人，AnalyticalChemistry-News&Features ，70 (1998)322A-327A或Butler,J.Ε·，Methods22 (2000)4-23〇
[0096] 在一個實施方案中，可檢測標記物選自生色原（熒光或發光基團和染料）、酶、 NMR-活性基團、金屬顆粒或半抗原如洋地黃毒甙。在一個實施方案中，可檢測標記物是洋地 黃毒甙。可檢測標記物也可以是光可活化交聯基團，例如疊氮基或氮丙啶基團。還在一個實 施方案中，可以通過電化學發光檢測的金屬螯合物是發出信號的基團，特別優選的是釕螯 合物，例如，釕（雙吡啶） 32+螯合物。合適的釕標記基團在例如EP0 580 979、W0 90/05301、 TO90/11511 和TO92/14138 中描述。
[0097] 不同免疫測定的原理例如由Hage,D.S. (Anal.Chem. 71 (1999) 294R-304R)描 述。Lu，B.等人（Analyst121(1996)29R-32R)報道了用于免疫測定中的抗體的定向固定 化。抗生物素蛋白-生物素介導的免疫測定例如由Wilchek,Μ.和Bayer,E.A.在Methods Enzymol. 184(1990)467-469 中報道。 具體實施方案
[0098] 本文中報道了使用血清樣品的干擾抑制性抗藥物抗體測定，所述測定具有增加的 對游離治療性抗體的耐受性和增加的對類風濕因子干擾的抵抗性。
[0099] 抗藥物抗體測定的原理是捕獲與洋地黃毒甙化的藥物（藥物-Dig)和生物素化的 藥物（藥物-Bi)(例如分別是托珠單抗（TCZ-Dig和TCZ-Bi))復合的抗藥物抗體（ADA)， 所述生物素化的藥物導致固定化到鏈霉親和素包被的平板（SA-MTP)上。與SA-MTP上的藥 物-Bi結合的ADA/藥物-Dig復合物由抗洋地黃毒甙抗體辣根過氧化物酶酶綴合物（抗 Dig-HRP)檢測。辣根過氧化物酶（HRP)催化底物ABTS的顏色反應。顏色強度與分析物的 濃度成比例。圖1中顯示抗藥物抗體測定的一般原理。
[0100] 已經發現在不改變一般測定原理的情況下，可以通過以下方式增加常規抗藥物抗 體測定的藥物和類風濕因子耐受性：
[0101] 1)增加生物素化和洋地黃毒甙化的捕獲試劑和示蹤試劑的濃度；
[0102] 2)同時，而非順序孵育血清樣品與捕獲試劑和示蹤試劑；
[0103] 3)延長血清樣品與捕獲試劑和示蹤試劑的孵育；
[0104] 4)使用均質捕獲試劑和示蹤試劑而非異質偶聯的混合物；
[0105] 5)使用增加的血清基質；
[0106] 6)納入寡聚IgG作為測定添加物；并且
[0107] 7)使用單生物素化的捕獲抗體和單洋地黃毒甙化的示蹤抗體。
[0108] 這些措施提供了協同效應。
[0109] 上述措施導致用于檢測針對治療性藥物抗體的抗藥物抗體的干擾抑制性藥物耐 受性抗藥物抗體測定。
[0110] 對于抗IL6R抗體托珠單抗示例的圖2中顯示了如本文中報道的干擾抑制性藥物 耐受性抗藥物抗體測定的一般原理。
[0111] 采用如本文中報道的測定設置，與常規抗藥物抗體測定相比，在來自患者的血清 樣品中ADA測定的藥物耐受性增加至少10倍。同時，還減少對導致假陽性測定結果的類風 濕因子的易感性。
[0112] 治療性抗炎癥抗體托珠單抗（TCZ)是針對白介素-6受體的重組人源化單克隆抗 體。已經顯示它在類風濕性關節炎的臨床研究中有效（0hsugi，Y.和Kishimoto，T.，Expert Opin.Biol.Ther. 8(2008)669-681)。這些研究中所用的ADA篩查和驗證測定顯示了使用靜 脈內給藥方案達到穩態時對常見TCZ血清濃度的足夠藥物耐受性。
[0113] 但是不同施用途徑（如皮下施用、更頻繁施用）和兒童中的新適應癥可能導致在 穩態時更高的TCZ血清濃度。
[0114] 另外，例如，類風濕因子（RF)經常在自身免疫疾病患者例如類風濕性關節炎患者 中顯著地增加。RF顯示偏好地與聚集的γ球蛋白結合并參與體內免疫復合物的清除機制 (Tatarewicz,S.等人，J.Immunol.Methods. 357 (2010) 10-16)。RF偏好五聚體免疫球蛋白 M(IgM)同種型（Artandi，S.E.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1991)94-98)并且可以 以多價態和中等親和力與治療性抗體的恒定部分非特異性結合，導致ADA測定中的假陽性 結果。例如，樣品稀釋劑中包含親和純化的兔抗人IgM抗體以克服RA樣品中交叉反應性 IgM抗體干擾（參見例如Araujo,J.等人，J.Pharm.Biomed.Anal.，55 (2011) 1041-1049) 〇
[0115] 已經發現可以通過在進行ADA測定之前向樣品添加寡聚人IgG，防止血清樣品中 存在的RF與治療性抗體的非特異性結合。添加的寡聚IgG為RF提供額外的靶并且在如本 文中報道的ADA測定中最大限度地消除RF的干擾。
[0116] 在下文中，通過分析托珠單抗（TCZ)治療的類風濕性關節炎患者的血清樣品，示 例如本文中報道的干擾抑制性ADA測定。
[0117] 增加用于檢測針對抗IL6R抗體托珠單抗的抗藥物抗體的常規抗藥物抗體測定的 藥物耐受性的措施是
[0118] 1)增加生物素化和洋地黃毒甙化的TCZ的濃度（例如從0. 5μg/mL至1. 5μg/ mL)；
[0119] 2)同時孵育血清樣品與TCZ-Bi和TCZ-Dig孵育；
[0120] 3)延長血清樣品與TCZ-Bi和TCZ-Dig的孵育（例如從1小時至16小時）；
[0121] 4)僅使用賴氨酸偶聯的TCZ-Bi試劑和TCZ-Dig試劑而非賴氨酸和糖偶聯試劑的 混合物；
[0122] 5)使用增加的血清基質含量；并且
[0123] 6)在孵育TCZ-Bi和TCZ-Dig之前向樣品添加寡聚人IgG。
[0124] 藥物耐夸件
[0125] 臨床樣品中待檢測的抗IL6R抗體托珠單抗的濃度是0. 5μg/mL或更高，經常在 1μg/mL至 10μg/mL范圍內。
[0126] 通過確定可以在分割點以上檢測到給定濃度的陽性對照ADA的最高TCZ濃度，評 價常規抗藥物抗體測定的藥物耐受性。表1展示了結果匯總。
[0127] 表1:測定常規抗藥物抗體ELISA中的藥物（托珠單抗）耐受性。左側對齊的信 號值低于平板特異性分割點〇. 136AU。
[0128]
[0129] 檢測到ADA濃度125ng/mL并在10μg/mlTCZ存在下測試為陽性。
[0130] 通過確定可以在分割點以上檢測到給定濃度的陽性對照ADA的最高TCZ濃度，評 價如本文中報道的干擾抑制性藥物耐受性抗藥物抗體測定的藥物耐受性。表2展示了結果 匯總。
[0131] 表2 :測定如本文中報道的干擾抑制性藥物耐受性抗藥物抗體ELISA中的藥物 (托珠單抗）耐受性。左側對齊的信號值低于平板特異性分割點〇. 045AU。
[0132]
[0134] 在如本文中報道的干擾抑制性藥物耐受性抗藥物抗體ELISA中，檢測到非常低 的ADA濃度30ng/mL并在10μg/mlTCZ存在下測試為陽性。另外，ADA濃度100ng/mL和 300ng/mL分別顯示30μg/ml和甚至100μg/mL的藥物抗體耐受性。
[0135] 與采用先前使用的托珠單抗的兩步驟常規抗藥物抗體ELISA所實施的相同實驗 比較揭示了采用干擾抑制性測定時至少10倍更高的藥物耐受性（對于300ng/mLADA濃度， 還參見圖4)。
[0136] 通過確定可以在分割點以上檢測到給定濃度陽性對照ADA的最高TCZ濃度，評價 分別用單價結合的生物素和洋地黃毒甙與捕獲和示蹤藥物抗體的1:1綴合物的如本文中 報道的干擾抑制性藥物耐受性抗藥物抗體測定的藥物耐受性。表3展示了結果匯總。
[0137] 表3 :測定如本文中報道的使用生物素和洋地黃毒甙與捕獲和示蹤藥物抗體的 1:1綴合物的干擾抑制性藥物耐受性抗藥物抗體ELISA中的藥物（托珠單抗）耐受性。左 側對齊的信號值低于平板特異性分割點〇. 037AU。
[0138]
[0139] 在如本文中報道的干擾抑制性藥物耐受性抗藥物抗體ELISA中，檢測到ADA濃度 250ng/mL并在80μg/mlTCZ存在下測試為陽性。
[0140] 干擾抑制：
[0141] 通過如Stubenrauch等人（上文）中所述的常規抗藥物抗體測定分析16份臨床 血清樣品。表4a中匯總結果。
[0142] 表4a:用根據Stubenrauch等人（上文）的ADA測定分析來自用托珠單抗治療的 類風濕性關節炎患者的16份血清樣品的結果。
[0143]
[0144] 在不改變分析原理的情況卜，米取一糸列宿施以獲得如本文中報道的干擾抑制性 藥物耐受性抗藥物抗體ELISA。
[0145] 這些是：
[0146] 1)增加生物素化和洋地黃毒甙化TCZ的濃度（例如從0. 5μg/mL至1. 5μg/mL);
[0147] 2)同時孵育血清樣品與TCZ-Bi和TCZ-Dig;
[0148] 3)延長血清樣品與TCZ-Bi和TCZ-Dig的孵育（例如從1小時至16小時）；
[0149] 4)僅使用賴氨酸偶聯的TCZ-Bi試劑和TCZ-Dig試劑而非賴氨酸和糖偶聯試劑的 混合物；
[0150] 5)使用增加的血清基質含量；并且
[0151] 6)在孵育TCZ-Bi和TCZ-Dig之前向樣品添加寡聚人IgG。
[0152] 下表4b中顯示如采用本文中報道的干擾抑制性測定所獲得的結果。
[0153] 表4b:采用常規和本文報告的干擾抑制性ADA測定對來自用托珠單抗治療的類風 濕性關節炎患者的16份血清樣品的對比性分析。
[0154]
[0155] 已經發現如果僅采取如上文概述的部分措施，則干擾作用的減少不充分并且仍易 遭受存在的類風濕因子的干擾，導致假陽性ADA測定結果。
[0156] 例如，如果僅采取以下措施
[0157] 1)增加生物素化和洋地黃毒甙化TCZ的濃度（例如從0. 5μg/mL至1. 5μg/mL);
[0158] 2)同時孵育血清樣品與TCZ-Bi和TCZ-Dig;
[0159] 3)延長血清樣品與TCZ-Bi和TCZ-Dig的孵育（例如從1小時至16小時）；
[0160] 4)僅使用賴氨酸偶聯的TCZ-Bi試劑和TCZ-Dig試劑而非賴氨