進行比較。圖3B中所示的結果顯示三種激動劑（褪黑激素、 碘褪黑激素和苯基褪黑激素）在來自對照受試者和AIS受試者的成骨細胞中引起不同程度 的反應。相較于對照組，對每種激動劑的反應在所有AIS組中較低。然而，在每個組中由于 AIS所致的幅度和降低反映了激動劑的功效，激動劑效力的順序是苯基褪黑激素〉碘褪黑 激素〉褪黑激素，如先前由其他研究者使用不同方法所報道（Nonno等，1999)。這表明褪黑 激素受體的活性在對照受試者與AIS患者之間是可比較的并且突出缺陷在褪黑激素受體 之外。
[0207]實施例6
[0208] 激動劑/受體復合物活化Gi蛋白的能力在AIS患者中對比對照中降低
[0209] 測試了以下可能性：褪黑激素信號傳導的缺陷可能與激動劑/受體復合物活化Gi 蛋白的能力降低有關。G蛋白拮抗劑GPAnt-2(-種疏水性肽）已經顯示通過與活化的受體 克爭與G蛋白相互作用而抑制受體/Gi蛋白偶聯（Mukai等，1992)。圖3C中所不的結果 顯示GPAnt-2在對照組和AIS功能組中以濃度依賴性方式抑制對褪黑激素刺激的反應。在 最大濃度下，降低的程度在所有組中是類似的，但在次最大濃度下，模式是明顯不同的。所 有三個AIS功能組的濃度反應曲線相較于對照組的濃度反應曲線表現出向左位移，并且當 與對照相比時，IC50值在AIS組之間顯著降低。考慮到GPAnt-2與不同G蛋白上的受體競 爭，通過將成骨細胞與增加濃度的百日咳毒素（PTX) -起孵育進一步選擇性地降低Gi蛋白 的量。據發現PTX處理降低FG2和FG3成骨細胞中對褪黑激素的細胞反應，從而表現出與 用GPAnt-2獲得的模式類似的模式。相比之下，PTX處理在最大濃度下增強FG1成骨細胞中 對褪黑激素的反應（圖3D)。這些數據表明AIS中降低的褪黑激素信號傳導最可能是由于 Gi蛋白對褪黑激素受體的敏感性降低，并且指示褪黑激素受體也可與分類在FG1中的AIS 患者中的Gs相互作用。
[0210] 實施例7
[0211] AIS受試者具有Gi蛋白介導的受體信號傳導的系統性和廣泛受損
[0212] 為了測定在AIS成骨細胞中測量的通過Gi蛋白信號傳導功能障礙是否限于褪黑 激素受體，用選擇性地活化與Gi蛋白偶聯的其他受體的不同合成化合物進行了對比研究。 使用五種化合物（包括愛帕林-17、PB554馬來酸鹽、溶血磷脂酸（LPA)、UK14304以及生長 激素抑制素）以分別活化內源性APJ受體、血清素5-HT1A受體、LPAi受體、α2-腎上腺素能 受體以及生長激素抑制素（sst)受體。如在圖4中所示，在所有對照組和AIS功能組中所 有測試的激動劑引起細胞反應的濃度依賴性增加，在同一濃度下達到穩定。在每種情況下， 當與對照組相比時，信號傳導反應的幅度在所有AIS組中較低，但EC50值在所有組中幾乎 是相同的，從而指示所有測試的激動劑對其對應受體的親和力在AIS中未受影響（圖4G)。 令人感興趣地，用所測試的五種合成激動劑中的任一種產生的GPAnt-2 (圖5)或PTX(圖6) 的抑制曲線揭示與用褪黑激素獲得的曲線模式類似的曲線模式。在每種情況下，當與對照 組相比時，GPAnt-2降低AIS組中的IC50值（圖5G)。當將GPAnt-2與肥大脫粒肽-7相比 較時也觀察到類似的反應（圖5F)，肥大脫粒肽-7通過模擬激動劑活化的受體直接活化Gi 蛋白（Higashijima等，1990)。此外，在用高濃度的PTX處理之后對肥大脫粒肽的反應幾乎 在所有AIS組和對照組中消除（圖6F)，從而指向在Gi蛋白水平下的異常。總的來說，這些 數據加強了以下概念：激動劑/受體相互作用在AIS中未受影響，并且揭示AIS患者可用活 化Gi蛋白介導的信號傳導途徑的任何化合物在功能上分層。
[0213] 將該分析延伸至來自相同組的對照和AIS患者的其他細胞類型，即骨骼肌成肌細 胞和外周血單核細胞（PBMC)。在這些細胞類型中獲得與針對所測試的每種激動劑在成骨細 胞中獲得的反應模式類似的反應模式（圖7和8)。總的來說，這些發現強烈指示Gi蛋白介 導的受體信號傳導的系統性和廣泛受損。
[0214]實施例8
[0215]Gi蛋白功能的降低選擇性地影響AIS中的Gs蛋白功能
[0216] 將來自對照和AIS患者的成骨細胞針對其對異丙腎上腺素和去氨加壓素的反應 進行篩選，所述異丙腎上腺素和去氨加壓素分別活化β-腎上腺素能受體和血管加壓素受 體（V2)。兩種受體均通過Gs蛋白介導信號轉導。圖9中所示的結果顯示當與對照成骨細 胞相比時，由兩種激動劑引發的細胞反應在來自AIS患者的成骨細胞中顯著增強。對于每 個功能組，對Gs刺激的反應增加相反地反映在Gi蛋白刺激之后誘導的降低的反應，從而表 明Gi蛋白與Gs蛋白之間的功能不均衡。為了進一步說明這種差異，將對褪黑激素和異丙 腎上腺素的反應的值報道為對Gi蛋白和Gs蛋白刺激的反應之間的差異（Δ)。如在圖9C 中所示，對Gi刺激的反應在對照組中以濃度依賴性方式顯著（即，大于約1. 5的Gi/Gs比 率）。在FG3組中觀察到類似的模式（S卩，大于約1.5的Gi/Gs比率），而在FG2組中未觀 察到明顯不均衡（S卩，介于約0. 5與1. 5之間的Gi/Gs比）。相比之下，FG1組表現出對Gs 刺激的反應的顯著性（劑，小于約0. 5的Gi/Gs比率）。這些數據指示Gs蛋白在AIS中根 據Gi蛋白功能的畸變程度在功能上受影響，從而揭示對每個AIS組特異的Gi與Gs蛋白功 能之間的不均衡概況。
[0217] 所呈現的結果揭示在AIS中降低的Gi蛋白功能與增加的Gs蛋白功能之間的關 系。Gi于Gs蛋白之間的功能不均衡概況是對于每個AIS組特異的，從而指示AIS能夠關于 對Gi和Gs蛋白刺激的反應之間的不均衡概況清楚地分離。這種方法有利地消除使用對照 受試者的必要性并且允許隨時間推移監測患者反應。
[0218] 然后研究Gq蛋白的功能狀態。將成骨細胞用緩激肽和內皮素-1刺激。兩種激動 劑在源自對照受試者和AIS患者的成骨細胞中在不同濃度下引發類似的反應，從而證明通 過Gq蛋白受體信號傳導在AIS中在很大程度上仍是完整的（圖9D-9E)。似乎AIS中Gi蛋 白功能的降低排他性地影響Gs蛋白功能。
[0219]實施例9
[0220] 表征三種AIS生物內在表型的反應程度的差異不是由于Gi蛋白的差異表達所致
[0221] 61蛋白的三種同種型（稱為611、6"和613)共有相同特性并且與61蛋白相互作 用的大多數膜性受體能夠經由這些同種型中的每種引發信號。然而，反應的幅度取決于Gi 同種型介導信號轉導的能力，而一些Gi同種型似乎比其他同種型更有效。
[0222] 測試了表征三種AIS生物內在表型的反應程度的差異是否是由于Gi蛋白同種型 的差異改變所致。首先檢查所觀察到的功能變化是否是由于G蛋白表達的變化所致。qPCR 分析揭示在對照與AIS成骨細胞之間無Gi蛋白的任何同種型（GipGijPGi3)和Gs蛋白 的表達的顯著變化（圖10A)。假定不同同種型的PCR擴增是同等有效的，似乎611和6"是 對照和AIS成骨細胞中的Gi蛋白的最豐富的同種型，而613同種型的表達水平豐度較低且 與Gs蛋白的表達水平類似。在蛋白質水平下，這些同種型還揭示在對照與任何AIS組之間 無差異（圖10B)。這些結果指示在來自AIS患者的成骨細胞中觀察到的功能變化不可能是 由于Gi蛋白同種型的表達水平的畸變所致。
[0223]實施例10
[0224] 差異磷酸化模式影響AIS功能組中的Gi蛋白同種型
[0225]Gi蛋白的活性通過磷酸化精確地調控，磷酸化是限制其轉導信號的能力的一個過 程（〇&86丫等，1995);(1(&七&(1&等，1985);(1(〇2&8&和6;[11]1&11，1996);(1^〇111181311^等，1991); (Lounsbury等，1993) ;(Morishita等，1995) ;(Morris等，1995) ;(Yatomi等，1992)。先 前報道了來自AIS患者的成骨細胞中的Gi蛋白的三種同種型Gi^GijPGi3的絲氨酸殘基 的磷酸化增加（Moreau等，2004)。為了檢查在AIS中發生的Gi信號傳導的功能破壞是否 可能與Gi磷酸化同種型的差異模式相關，將來自對照受試者和來自每種生物內在表型的 AIS患者的Gi同種型免疫沉淀且用抗磷酸-絲氨酸抗體探測（圖11)。與對照組相比，僅 GijPGi3同種型是在FG3組中磷酸化的，而僅GiJPGi2是在FG2組中磷酸化的。然而，三 種同種型GipGijPGi3是在FG1組中磷酸化的。這些數據提供AIS中Gi同種型的磷酸化 模式與Gi蛋白的異源缺陷之間的關系的證據，并且指示AIS組之間Gi蛋白同種型的功能 狀態的差異。
[0226]實施例11
[0227] 差異磷酸化模式影響AIS功能組中的Gi蛋白同種型
[0228] 在用褪黑激素、LPA或生長激素抑制素刺激成骨細胞之前，使用小干擾 RNA(siRNA)方法單獨地或組合地敲低Gi^GipGijPGs的表達來測試每個AIS組中負責殘 余反應的Gi同種型的身份。每種基因的沉默使來自對照和三個AIS組的成骨細胞中的相 應mRNA的表達降低75% -85% (圖12E-12H)。在對照組中，當單獨轉染時對任何所測試的 激動劑的反應未受GipGi2、Gi3siRNA顯著影響，但當一起轉染時所述反應幾乎被消除（圖 12A)。對每種測試的激動劑的反應在FG2成骨細胞中通過單獨沉默Gi』#低至少75% (圖 12C)，并且在FG3成骨細胞中通過單獨沉默GiJ#低至少90% (圖12D)，從而證實對Gi刺 激的殘余反應分別是由FG2和FG3組中的GijPGii同種型介導的。在FG1成骨細胞中，在 通過siRNA缺失所有Gi同種型之后對每種激動劑的反應被降低50%，并且未受單獨Gi同 種型的敲低影響（圖12B)。相比之下，單獨Gs的缺失使FG1AIS組中對任何測試的激動劑 的細胞反應降低50%，并且在對照、FG2和FG3AIS組中沒有作用。這指示在FG1功能組中 對Gi刺激的殘余反應是同時偶聯至Gs和Gi蛋白的Gi受體的相加作用。
[0229]分別檢測FG2和FG3組中未磷酸化的Gii同種型能夠解釋當與FG1組相比 時它們的更高Gi信號傳導活性。然而，當與FG3成骨細胞相比時，FG2成骨細胞表現出弱 得多的參與Gi信號傳導活性，這可由以下事實來解釋：613同種型在人成骨細胞中豐度較 低如實施例9中所展示（圖10)。分別選擇性缺失FG2和FG3成骨細胞中的GijPGi1同 種型幾乎以與圖12中展示的類似方式消除其對三種不同Gi偶聯受體的細胞反應，從而進 一步證實這兩個AIS組中Gi#PGii同種型的功能狀態。試圖推測其他Gi同種型的功能損 失可由FG2中的613同種型和FG3組中的Gii補償，這與每個Gi同種型能夠部分拯救Gi信 號傳導一致（Hurst等，2008)。
[0230] 不受所述假設限制，這些發現連同來自高PTX濃度實驗的結果表明涉及FG1成骨 細胞中的其他G蛋白的補償機制。概念上，有可能所有Gi同種型的磷酸化允許或促進FG1 成骨細胞中Gs蛋白與Gi偶聯受體的偶聯。這種可能性由Gs和所有Gi同種型的同時缺失 清楚地證明，它們幾乎在FG1成骨細胞中完全消除信號傳導活性。另一方面，所測試的三種 GPCR未活化FG2和FG3成骨細胞中的Gs介導的信號傳導，這強烈表明Gs蛋白對這些受體 的可及分別受GijPGii同種型限制，所述同種型在這些組中不是磷酸化的。值得注意，單 獨缺失Gs蛋白不會消除FG1成骨細胞中的信號傳導活性，但是事實是所有三種Gi同種型 都是磷酸化的，從而表明在AIS功能組間磷酸化的絲氨酸殘基的數目和位置的可能不均勻 性。可設想與FG2和FG3組中的磷酸化的Gi同種型相反，FG1成骨細胞中的磷酸化的Gi蛋 白仍然表現出一些殘余活性。
[0231]實施例12
[0232] 促成AIS中的Gi蛋白功能減退的絲氨酸/蘇氨酸激酶的鑒別
[0233] 為了鑒別磷酸化AIS中的Gi同種型的推定絲氨酸/蘇氨酸激酶，將對照和AIS成 骨細胞用一組絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑進行處理，之后用兩種不同激動劑（LPA和生長激 素抑制素）刺激它們。值得注意，在對照成骨細胞中由其激動劑經由LPA和生長激素抑制素 受體誘導的Gi刺激未受任何激酶抑制劑影響（圖13)。相比之下，信號傳導反應在FG1成骨 細胞中通過G58963顯著增加，所述G68963抑制PKC的幾種同種型；并且還通過ST0-609 乙酸鹽顯著增增加，所述ST0-609乙酸鹽抑制鈣調蛋白激酶的三種同種型（CaMKl、CaMK2、 CaMK4);但未受選擇性地抑制CaMK2的KN93影響。然而，兩種CaMK抑制劑ST0-609乙酸 鹽和KN93均增加來自FG2組的成骨細胞中的信號傳導反應，而G68963在所述AIS組中沒 有顯著作用。FG3成骨細胞中的細胞反應未通過抑制PKC和CaMK得到改進。相比之下，用 D4476抑制酪蛋白激酶2(CK2)增加來自FG1和FG3組的成骨細胞中的反應，但在FG2成骨 細胞中未增加，同時用H89抑制PKA增加所有AIS組中的信號傳導反應。
[0234] 表達分析已經揭示當與對照組相比時，FG1成骨細胞中的PKCe、PKCn和 CaMKl-δ的表達水平的選擇性增加（圖14)。FG2和FG3成骨細胞僅表現出ΡΚΑγ2的高表 達水平。相比之下，CaMK2nl(-種天然CaMK2抑制劑）在FG2成骨細胞中顯著減少，從而 表明CaMK2活性的調控系統在所述AIS組中受影響（圖14)。其他分析的激酶的表達水平 未顯示任何顯著選擇性增加或減少（圖15-16)。總的來說，這些結果顯示AIS中的Gi蛋白 同種型的選擇性功能改變涉及不同激酶。
[0235] 權利要求的范圍不應受實施例中闡明的優選實施方案的限制，而是應給予總體上 與說明書一致的最廣泛的解釋。
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