Gi蛋白磷酸化作為脊柱側凸和脊柱側凸進展的標記物，增加脊柱側凸受試者中的GiPCR信 ...的制作方法
【專利說明】Gi蛋白磷酸化作為脊柱側凸和脊柱側凸進展的標記物，增 加脊柱側凸受試者中的GiPCR信號傳導的方法
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請是2014年6月16日提交并且根據PCT條約第21條⑵款以英文公布的 PCT申請序列號PCT/CA2014/*，本申請要求2013年6月17日提交的美國臨時申請序列號 61/835,839的權益。以上所有文件以引用的方式整體并入本文。 發明領域
[0003] 本發明涉及脊柱側凸和脊柱側凸進展的標記物。更具體地說，本發明涉及Gi蛋白 磷酸化作為脊柱側凸和脊柱側凸進展的標記物、增加脊柱側凸受試者中的GiPCR信號傳導 的方法以及其用于分層脊柱側凸患者和預測發展脊柱側凸的風險的用途以及增加脊柱側 凸受試者中的GiPCR信號傳導的方法。
[0004] 對序列表的引用
[0005]根據 37C.F.R. 1. 821 (c)，序列表特此作為命名為 14033_122_ST25.txt的ASCII兼 容文本文件提交，它是在2014年6月16日創建并且具有57千字節的大小。上述文件的內 容特此以引用的方式整體并入。
[0006] 發明背景
[0007] 特發性脊柱側凸是不明原因的脊柱畸形，其通常被定義為伴有脊椎旋轉的大于10 度的側彎^青少年特發性脊柱側凸（AIS)是全世界最頻繁的幼年期畸形之一，其特征在于 不明原因的3D脊柱畸形，并且既代表直接的醫學挑戰，又代表終生影響個體的慢性病狀。 它是青少年中最常見的需要外科手術的矯形病狀，并且影響4%的此群體。所述病狀最常見 地在9至13歲的年齡之間被診斷 2'3'4。所述診斷主要是排除并且僅在排除脊柱畸形如椎骨 畸形、神經肌肉病癥或綜合征病癥的其他原因之后進行。傳統地，軀干不對稱在身體檢查期 間通過亞當斯前屈測試揭示并且用脊柱側凸測量計測量 5。然后可以使用科布方法通過彎 曲的影像學觀察和角度測量來確認所述診斷6。
[0008] -旦診斷，醫師在管理脊柱側凸兒童方面的主要關注是彎曲是否將進展。確實，彎 曲進展經常是不可預測的并且在女孩之中比在男孩中更頻繁地觀察到 7。如果未經治療，彎 曲可能急劇進展，從而產生顯著身體畸形且甚至心肺問題。當彎曲超過70度時，這些表現 形式變得威脅生命 8'9。用于預防或終止彎曲進展的當前治療選擇包括裝矯正架和外科手 術。一般來說，對于在25與40度之間的彎曲推薦裝矯正架，而對大于45度的彎曲或對裝矯 正架無反應的彎曲保留外科手術。當前在美國，大約一百萬的10與16歲之間的兒童具有 某種程度的IS。大約10%的被診斷具有特發性脊柱側凸的兒童具有需要矯形外科手術的 彎曲進展 ' 每年在北美進行約29, 000例脊柱側凸外科手術，從而導致顯著的心理和生理 發病率。（GoldbergMS,MayoNE，PoitrasB等TheSte-JustineAdolescentIdiopathic ScoliosisCohortStudy.PartI:Descriptionofthestudy.Spine1994 ； 19:1551-61 ； PoitrasB,MayoNE,GoldbergMS等TheSte-JustineAdolescentIdiopathicScoliosis CohortStudy.PartIV:Surgicalcorrectionandbackpain.Spinel994 ; 19:1582-8)〇
[0009] 當前，沒有可靠的方法或測試可供用于鑒定處于發展IS的風險的受試者以預測 哪些受影響的個體需要治療來預防或終止所述疾病的進展，以使得可以盡早提供適當治療 并且預防外科手術并發癥以及心臟和/或呼吸問題。（WeinsteinSL，DolanLA,ChengJC 等Adolescentidiopathicscoliosis.Lancet2008;371:1527-37)。
[0010] 因此，當前治療如裝矯正架或外科手術矯正的應用被延遲直到檢測到顯著畸形或 直到清楚地展示顯著進展，從而導致延遲的、不太理想的治療并且通常導致嚴重的心理后 遺癥（SocietySR.Morbidity&MortalityCommitteeannualReport1997) 〇
[0011] 當前，為了檢測畸形，使診斷的兒童在幾年內經受多次射線照相，通常直到他們達 到骨骼成熟。據估計，患有脊柱側凸的典型患者將在3年時期內具有大約22次放射學檢查 n。多次射線照相檢查存在潛在風險。也是由于這一原因，能夠允許進行特發性脊柱側凸的 預后的替代方法是強烈合乎需要的。
[0012] 在開發能夠有助于患者的治療選擇的診斷測試方面的主要限制是AIS的異質性 質。在臨床水平，AIS的異質性通過彎曲形態的變化性、定位和彎曲幅度、甚至在具有多個 受影響的成員的家庭清楚地顯示。
[0013] 在不存在可靠的AIS表型的情況下，需要更好地了解與疾病發作和脊柱畸形進展 相關的分子變化。疾病的分子定義正在迅速替代傳統的基于病理學的疾病描述，這是部分 由于其在鑒定針對患者的最佳治療方案中的效用。
[0014] 為此目的，在AIS患者之中報道了差別褪黑激素信號傳導功能障礙的存在，從而 導致他們分層為三種功能組或生物內在表型（Moreau等，2004) ;(Azeddine等，2007); (Letellier等，2008)以及Moreau的W02003/073102。更具體地說，AIS患者被分層為代 表不同生物內在表型的三個功能組（FG1、FG2和FG3)。使用這種方法，當與健康對照受試 者相比時，脊柱側凸患者和處于更高發展脊柱側凸風險的兒童對Gi蛋白刺激的反應較小， 并且所述分類是基于相對于對照組的減少程度的百分比。分類范圍對于FG3被固定在10% 與40%之間，對于FG2被固定在40%與60%之間且對于FG1被固定在60%與90%之間。
[0015] 最近，使用細胞介電譜（CDS)技術（其是用于G蛋白以及偶聯至所述蛋白的內源 性受體的功能評價的無標記方法（Verdonk等，2006))，據發現，在通過褪黑激素刺激退黑 激素受體之后的細胞反應在正常成骨細胞中主要是Gi依賴性的并且在來源于AIS患者的 成骨細胞中減少至不同程度（Akoume等，2010)。大約33%的被診斷具有缺陷型Gi蛋白功 能的無癥狀兒童已在許多年之后發展脊柱側凸（Akoume等，2010)。
[0016] 脊柱側凸的早期檢測/預后不僅是對于成功的和侵入性更小的臨床結果來說關 鍵的，而且擴大臨床醫師的治療選擇范圍。確實，改進患者分層和疾病分期代表在患者的脊 柱畸形太晚期之前選擇用于微創外科手術的AIS患者的關鍵步驟。
[0017] 本說明書參考多個文獻，所述文獻的內容以引用的方式整體并入本文。
[0018] 發明概述
[0019] 本發明提供以下臨床證據：Giα亞基的差別破壞出現在AIS中，并且證明這種受 損是由不同Gi同種型的絲氨酸磷酸化引起的，從而導致將AIS患者分類成表示可遺傳性狀 的三種生物內在表型。在檢測受脊柱側凸影響的所有家族成員中的同一內在表型的情況下 清楚地證明遺傳性。根據AIS患者的生物內在表型評價AIS患者的臨床結果揭示，在兩個 不同組（加拿大人和意大利人）中分類在FG2內在表型中的AIS患者更易于發展嚴重脊柱 側凸，而分類在FG1內在表型中的AIS患者呈現低得多的疾病進展風險。
[0020] 在機制體外研究中，進一步觀察到出現在AIS中的Gi蛋白的功能減退導致（a)差 異地擾亂不同細胞類型中的所有Gi偶聯受體的系統性和廣泛信號傳導缺陷，（b)Gs偶聯 受體信號傳導的增強，而Gq偶聯受體信號轉導未受損，以及（c)選定激酶的藥理學抑制拯 救或改進細胞水平下的Gi信號傳導損傷并且這種反應在每種生物內在表型的功能方面變 化。所述信號傳導缺陷是由于涉及不同激酶的各組中的Gia亞基同種型的選擇性磷酸化 所致，即：FG3具有無磷酸化絲氨酸的Giα1和絲氨酸磷酸化的Giα2和Gia3 ;FG2具有無 磷酸化絲氨酸的Giα3和絲氨酸磷酸化的Giα1和Giα2 ;并且FG1具有絲氨酸磷酸化的 Gial、Giα2 和Giα3〇
[0021] 這些發現提供以下證據：Gi信號傳導的差別破壞突出AIS發病機制，并且代表開 發創新型診斷工具和藥理學療法的理性基礎。
[0022] 更具體地說，根據本發明，提供一種分層患有青少年特發性脊柱側凸（AIS)的受 試者的方法，所述方法包括：（i)提供從所述受試者分離的細胞樣品；和（ii) (a)測定所述 細胞樣品中的Giα1的絲氨酸磷酸化；(b)測定所述細胞樣品中的Giα3的絲氨酸磷酸化； (c)測定所述細胞樣品中對Gia和Gsa蛋白刺激的反應之間的差異（Δ);或（d) (a)至 (c)的任何組合；由此檢測步驟的結果使能夠將患有AIS的受試者分層為屬于AIS亞類。
[0023] 根據本發明的另一方面，提供一種預測受試者中發展嚴重脊柱側凸的風險的方 法，所述方法包括：（i)提供從所述受試者分離的細胞樣品；（ii) (a)測定所述細胞樣品中 的Giα3蛋白的絲氨酸磷酸化；(b)測定所述細胞樣品中對Giα和Gsα蛋白刺激的反應 之間的差異（Α);和/或（c)測定所述細胞樣品中對激動劑的GiPCR反應，其中（a)Gia3 蛋白的絲氨酸磷酸化的不存在；(b)測定Gia/Gsα比率在約〇. 5與1. 5之間；和/或（c) 所述細胞樣品中的GiPCR反應比對照樣品中的GiPCR反應低約40%至60 %指示所述受試 者處于發展嚴重脊柱側凸的風險。
[0024] 在一個具體實施方案中，所述受試者是被診斷患有脊柱側凸的受試者。
[0025] 在一個具體實施方案中，所述受試者可能發展脊柱側凸。在另一個具體實施方案 中，所述脊柱側凸是青少年特發性脊柱側凸。在另一個具體實施方案中，方法是在體外。 在另一個具體實施方案中，所述細胞樣品包含成骨細胞、成肌細胞和/或外周血單核細胞 (PBMC)。在另一個具體實施方案中，所述細胞樣品包含PBMC。在另一個具體實施方案中，所 述細胞包含淋巴細胞。
[0026] 根據本發明的另一方面，提供一種增加有需要的受試者（例如，被診斷患有脊柱 側凸或可能發展脊柱側凸）的細胞中的GiPCR信號傳導的方法，所述方法包括向所述受試 者施用有效量的：（i)PKA的抑制劑；或（ii) (a)PKC的抑制劑；(b)CaMKl或4的抑制劑；（c) CK的抑制劑；或（d) (a)至（c)中的至少兩者的任何組合，如果所述受試者的細胞具有絲氨 酸磷酸化的Gail、Gai2和Gai3蛋白；（iii)CaMK2的抑制劑，如果所述受試者的細胞不 存在Gai3上的絲氨酸磷酸化；或（iv)CK的抑制劑，如果所述受試者的細胞不存在Gail 上的絲氨酸磷酸化，由此所述GiPCR信號傳導在所述受試者的細胞中增加。
[0027] 根據本發明的另一方面，提供以下各項的用途：（i)PKA的抑制劑；或（ii) (a)PKC 的抑制劑；(b)CaMKl或4的抑制劑；（c)CK的抑制劑；或（d) (a)至（c)中的至少兩者的任 何組合；如果所述受試者的細胞具有絲氨酸磷酸化的Gail、Gai2和Gai3蛋白；（iii) CaMK2的抑制劑，如果所述受試者的細胞不存在Gai3上的絲氨酸磷酸化；或（iv)CK的抑 制劑，如果所述受試者的細胞不存在Gail上的絲氨酸磷酸化，其用于增加有需要的受試 者（例如，被診斷患有脊柱側凸或可能發展脊柱側凸）的細胞中的GiPCR信號傳導或用于 制造用以增加有需要的受試者（例如，被診斷患有脊柱側凸或可能發展脊柱側凸）的細胞 中的GiPCR信號傳導的藥劑。
[0028] 根據本發明的另一方面，提供一種用于增加有需要的受試者（例如，被診斷患有 脊柱側凸或可能發展脊柱側凸）的細胞中的GiPCR信號傳導的組合物，所述組合物包含： (i) PKA的抑制劑；或（ii) (a)PKC的抑制劑；(b)CaMKl或4的抑制劑；(c)CK的抑制劑； 或（d) (a)至（c)中的至少兩者的任何組合；如果所述受試者的細胞具有絲氨酸磷酸化的 Gail、Gai2和Gai3蛋白；（iii)CaMK2的抑制劑，如果所述受試者的細胞不存在Gai3上 的絲氨酸磷酸化；或（iv)CK的抑制劑，如果所述受試者的細胞不存在GaΠ上的絲氨酸磷 酸化。
[0029] 根據本發明的另一方面，提供一種包含以下各項的組合物：（i)PKA的抑制劑；或 (ii) (a)PKC的抑制劑；(b)CaMKl或4的抑制劑；(c)CK的抑制劑；或（d) (a)至（c)中的至少 兩者的任何組合；如果所述受試者的細胞具有絲氨酸磷酸化的Gail、Gai2和Gai3蛋白； (iii)CaMK2的抑制劑，如果所述受試者的細胞不存在Gai3上的絲氨酸磷酸化；或（iv)CK 的抑制劑，如果所述受試者的細胞不存在Gail上的絲氨酸磷酸化。在本發明的具體實施 方案中，所述組合物還包含藥學上可接受的載體。
[0030] 根據本發明的另一方面，提供一種用于分層患有青少年特發性脊柱側凸（AIS)的 受試者的試劑盒，所述試劑盒包括：(a)用于檢測所述細胞樣品中Gia1上不存在絲氨酸磷 酸化的配體；(b)用于檢測所述細胞樣品中Gia3上不存在絲氨酸磷酸化的配體；（c)用于 檢測Gia和Gsa的配體；或（d) (a)至（c)的任何組合。
[0031] 根據本發明的另一方面，提供一種用于預測受試者中發展嚴重脊柱側凸的風險的 試劑盒，所述試劑盒包括：（a)用于檢測Giα3上不存在絲氨酸磷酸化的配體；(b)用于檢 測Giα和Gsα的配體；或（c) (a)與（b)的組合。
[0032] 根據本發明的另一方面，提供一種用于增加有需要的受試者的細胞中的GiPCR信 號傳導的試劑盒，所述試劑盒包括：(a)PKA的抑制劑；(b)PKC的抑制劑；（c)CaMKl或4的抑 制劑；（d)CK的抑制劑；（e)CaMK2的抑制劑；或（f) (a)和（e)中的至少兩者的任何組合。
[0033] 在本發明的具體實施方案中，PKA的抑制劑是PKA-γ2的抑制劑。在另一個具體 實施方案中，ΡΚΑ的抑制劑是Η89。在另一個具體實施方案中，PKC的抑制劑是PKC-n或 PKC-ε的抑制劑。在一個具體實施方案中，PKC的抑制劑是G06983。在一個具體實施方 案中，CaMKl的抑制劑是CaMklδ。在一個具體實施方案中，CaMKl或CaMK4的抑制劑是 ST0609。在一個具體實施方案中，CK的抑制劑是CK2的抑制劑。在一個具體實施方案中， CK的抑制劑是D4476。在一個具體實施方案中，CaMK2的抑制劑是ST0609或KN93。在一個 具體實施方案中，有需要的受試者是被診斷患有脊柱側凸的受試者。在一個具體實施方案 中，有需要的受試者可能發展脊柱側凸。在一個具體實施方案中，所述脊柱側凸是青少年特 發性脊柱側凸。在一個具體實施方案中，所述方法是在體外。
[0034] 根據本發明的另一方面，提供一種選擇作為減輕或預防脊柱側凸的潛在候選物的 藥劑的方法，所述方法包括使候選藥劑與表達（a)PKA、（b)PKC、（c)CaMKl、（d)CaMK4、（e)CK、 (f)CaMK2的細胞相接觸，其中當（a)至（f)中的任一者的表達或活性降低時，選擇所述候選 藥劑。
[0035] 在本發明的具體實施方案中，PKA是ΡΚΑ-γ2。在本發明的其他具體實施方案中， PKC是PKC-η或PKC-ε。在本發明的其他具體實施方案中，CaMKl是CaMKlδ。在本發明 的其他具體實施方案中，CK是CK2。
[0036] 在一些方面，本發明涉及一種分層患有青少年特發性脊柱側凸（AIS)或處于發展 青少年特發性脊柱側凸的風險的受試者的方法，所述方法包括：（i)提供從所述受試者分 離的細胞樣品；（ii)從所述細胞樣品檢測或測定所述受試者的Gia蛋白絲氨酸磷酸化概 況和/或對Gia和Gsa蛋白刺激的反應的不均衡程度；以及（iii)基于所述受試者的 Gia蛋白絲氨酸磷酸化概況和/或對Gia和Gsa蛋白刺激的反應的不均衡程度將所述受 試者分層為臨床上有用的AIS亞類。
[0037] 在一些實施方案中，以上提及的方法包括：（a)檢測或測定所述細胞樣品中的 Giα1的絲氨酸磷酸化；(b)檢測或測定所述細胞樣品中的Giα3的絲氨酸磷酸化；（c)檢 測或測定所述細胞樣品中對Gia蛋白刺激的反應與對Gsa蛋白刺激的反應之間的比率 (Gia/Gsa反應比率）或差異（Δ);或（d) (a)至（c)的任何組合。
[0038] 在一些實施方案中，以上提及的方法還包括：將所述受試者分層為屬于：（1)第一 AIS亞類，其特征在于：(a)絲氨酸磷酸化的Giα1和Giα3蛋白的水平相較于對應于對照 的絲氨酸磷酸化的Giα1和Giα3蛋白的水平升高；和/或（b)在約0. 5以下的Gia/Gsα 反應比率；（2)第二AIS亞類，其特征在于：(a)絲氨酸磷酸化的Giα1蛋白的水平相較于 對應于對照的絲氨酸磷酸化的Giα1蛋白的水平升高，而絲氨酸磷酸化的Giα3蛋白的水 平相較于對應于對照的絲氨酸磷酸化的Giα3蛋白的水平未升高；和/或（b)介于約0. 5 與1. 5之間的Gia/Gsα反應比率；或⑶第三AIS亞類，其特征在于：（a)絲氨酸磷酸化 的Giα3蛋白的水平相較于對應于對照的絲氨酸磷酸化的Giα3蛋白的水平升高，而絲氨 酸磷酸化的Giα1蛋白的水平相較于對應于對照的絲氨酸磷酸化的Giα1蛋白的水平未升 高；和/或（b)在約1. 5以上的Gia/Gsα反應比率。
[0039] 在一些實施方案中，以上提及的方法還包括檢測或測定所述細胞樣品中的Giα2 蛋白的絲氨酸磷酸化，其中相較于對應于對照的絲氨酸磷酸化的Giα2蛋白的水平，檢測 到絲氨酸磷酸化的Giα2蛋白的水平升高。
[0040] 在以上提及的方法的一些實施方案中，（1)屬于第一AIS亞類的受試者具有低的 嚴重AIS進展風險；（2)屬于第二AIS亞類的受試者具有高的嚴重AIS進展風險；并且（3) 屬于第三AIS亞類的受試者具有中等嚴重AIS進展風險。
[0041] 在一些方面，本發明涉及一種預測患有脊柱側凸或處于發展脊柱側凸的風險的受 試者中發展嚴重脊柱側凸的風險的方法，所述方法包括：（i)提供從所述受試者分離的細 胞樣品；（ii)檢測或測定：(a)所述細胞樣品中Giα3蛋白的絲氨酸磷酸化；(b)所述細胞 樣品中對Giα和Gsα蛋白刺激的反應；和/或（c)所述細胞樣品中對激動劑的GiPCR反 應；（iii)當：(a)所述細胞樣品中的絲氨酸磷酸化的Giα3蛋白未被檢測到或相較于對應 于對照的絲氨酸磷酸化的Giα3蛋白的水平未升高；(b)所述細胞樣品中對Giα蛋白刺激 的反應與對Gsα蛋白刺激的反應的比率（Gia/Gsα反應比率）介于約〇. 5與1. 5之間； 和/或（c)檢測到所述細胞樣品中的GiPCR反應比對照樣品中的GiPCR反應低約40 %至 60 %時，確定所述受試者處于發展嚴重脊柱側凸的風險。
[0042] 在以上提及的方法的一些實施方案中，步驟（ii)還包括檢測或測定所述細胞樣 品中的Gia1和/或Gia2蛋白的絲氨酸磷酸化，其中當所述受試者的絲氨酸磷酸化的Gia1或Gia2蛋白的水平相較于對應于對照的絲氨酸磷酸化的Gia1或Gia2蛋白的水 平升高時，所述受試者處于發展嚴重脊柱側凸的風險。
[0043] 在一些方面，本發明涉及一種預測患有脊柱側凸的受試者對裝矯正架治療的反應 性的方法，所述方法包括：α)提供從所述受試者分離的細胞樣品；以及αυ檢測或測定： (a)所述細胞樣品中的Gia1的絲氨酸磷酸化；(b)所述細胞樣品中的Gia3的絲氨酸磷 酸化；（c)所述細胞樣品中對Gia和Gsa蛋白刺激的反應；或（d) (a)至（c)的任何組合； (iii)當：(a)檢測到絲氨酸磷酸化的Gia3蛋白的水平相較于對應于對照的絲氨酸磷酸化 的Giα3蛋白的水平升高，而絲氨酸磷酸化的Giα1蛋白的水平相較于對應于對照的絲氨 酸磷酸化的Giα1蛋白的水平未升高；和/或（b)所述細胞樣品中對Giα蛋白刺激的反應 與對Gsα蛋白刺激的反應的比率（Gia/Gsα反應比率）在約1. 5以上時，確定所述受試 者可能對裝矯正架治療有反應。
[0044] 在一些實施方案中，以上提及的受試者是被診斷患有脊柱側凸的受試者。在一些 實施方案中，所述脊柱側凸是青少年特發性脊柱側凸（AIS)。
[0045] 在一些實施方案中，以上提及的方法是在體外。
[0046] 在一些實施方案中，以上提及的細胞樣品包含成骨細胞、成肌細胞和/或外周血 單核細胞（PBMC)。在一些實施方案中，以上提及的細胞樣品包含PBMC。在一些實施方案中， 以上提及的PBMC包含淋巴細胞。
[0047] 在一些實施方案中，以上提及的檢測或測定細胞樣品中的Giα1和/或Giα3蛋 白的絲氨酸磷酸化包括從所述細胞樣品分離Giα1和/或Giα3蛋白以及使所述分離的 Giα1和/或Giα3蛋白與抗磷酸絲氨酸抗體相接觸。
[0048] 在一些方面，本發明涉及一種增加患有脊柱側凸或處于發展脊柱側凸的風險的受 試者的細胞中的GiPCR信號傳導的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的：（i)PKA的抑制劑；（ii) (a)PKC的抑制劑；(b)CaMKl或4的抑制劑；（c)CK的抑制劑；或（d) (a) 至（c)中的至少兩者的任何組合；如果所述受試者的