和 5 mmol/L的鐵氰化鉀的磷酸鹽緩沖液中的循環伏安表征:(a)空絲網印刷電極；(b)Fe304-CS/SPCE ;(c)AChE/0MC-CS/Fe304-CS/SPCE ；(d) 0MC-CS/Fe304_CS/SPCE
圖 4 AChE/0MC-CS/Fe304-CS/SPCE 傳感器組裝過程中含 1.0 mM ATCl pH 7.5 磷酸鹽緩沖液中的循環伏安表征:(a)空的絲網印刷電極；(b) Fe304-CS/SPCE; (c) OMC-CS/Fe304-CS/SPCE; (d) AChE/0MC-CS/Fe304-CS/SPCE 傳感器農藥抑制 1min; (e) AChE/OMC-CS/ Fe3O4-CS/ SPCE
圖5底液pH值對傳感器電流響應的影響圖6酶負載量對傳感器電流響應的影響圖7孵化時間對傳感器電流相應的影響圖8 AChE/0MC-CS/Fe304-CS/SPCE傳感器被不同濃度甲胺磷農藥抑制后在含有1.0mmol/LATCl的pH為8.0的磷酸鹽緩沖液中差分脈沖伏安曲線，甲胺磷濃度:a_k: O yg/L;I μ g/L; 10 μ g/L; 20 μ g/L; 30 μ g/L; 40 μ g/L; 50 μ g/L; 100 μ g/L; 200 μ g/L; 400 μ g/L; 600 μ g/L
圖9抑制率與甲胺磷濃度的對數的線性關系圖10抑制率與毒死蜱濃度的對數的線性關系
圖11 AChE/0MC-CS/Fe304-CS/SPCE傳感器對實際樣品加標回收率的檢測。
【具體實施方式】
[0016]下面結合具體實施例對本發明做進一步說明，但本發明不受實施例的限制。
[0017]實施例1 一種基于絲網印刷電極檢測有機磷農藥的傳感器的制備方法，
O納米四氧化三鐵-殼聚糖復合物和有序介孔碳-殼聚糖復合物的制備:稱取0.5 g殼聚糖置于燒杯中，加入1.0 %的醋酸溶液攪拌溶解，將溶解好的溶液置于250 mL容量瓶中并定容，定容后的溶液倒入燒杯中，在磁力攪拌器下磁力攪拌10 h，得到0.2%的殼聚糖溶液；取納米四氧化三鐵顆粒2 mg，分散于4 mL 0.2%的殼聚糖溶液中，在超聲波清洗機中超聲至分散均勻，得到0.5 mg/mL納米四氧化三鐵-殼聚糖復合物；取2 mg有序介孔碳溶于4 ml的0.2%殼聚糖溶液中，在超聲波清洗機中超聲I小時得到均一、淺黑色的懸濁液，即為0.5 mg/mL有序介孔碳-殼聚糖復合物；
2)絲網印刷電極的清洗、活化:首先，將絲網印刷碳電極放入盛有ImMNaOH溶液的小燒杯中超聲清洗5分鐘，超純水清洗，氮氣吹干。然后，將電極放入盛有ImM HCl溶液的小燒杯中超聲清洗5分鐘，超純水清洗，氮氣吹干。之后，用無水乙醇清洗電極，氮氣吹干。最后，在pH=5的磷酸鹽緩沖液中進行電流-時間曲線掃描300s，之后，進行循環伏安曲線掃描，直至性能穩定；
3)絲網印刷電極的修飾:在絲網印刷電極上滴加8μ L 0.5 mg/mL的四氧化三鐵-殼聚糖溶液，在室溫下放置自然干燥，得到四氧化三鐵-殼聚糖電極，接著在滴加過四氧化三鐵-殼聚糖溶液的電極上滴加8 μ L 0.5 mg/mL的介孔碳-殼聚糖溶液，在室溫條件下放置自然干燥，得到四氧化三鐵-殼聚糖/介孔碳-殼聚糖電極；
4)乙酰膽堿酯酶的固定:在上述的電極上滴加5μ L 0.02 U的乙酰膽堿酯酶，在4°C條件下干燥，得到乙酰膽堿酯酶生物傳感器，并將制備好的電極放于4 °(:干燥的環境中保存備用。
[0018]實施例2乙酰膽堿酯酶生物傳感器組裝過程中的電化學表征
1)運用掃描電子顯微鏡(SEM)對修飾有介孔碳-殼聚糖的絲網印刷電極的微觀結構圖進行表征，如圖1和圖2所示，可以看到介孔碳-殼聚糖懸浮液成功修飾到電極表面；
2)組裝過程中不同電極在含0.1 mol/L KCl和5 mmol/L的鐵氰化鉀的磷酸鹽緩沖液中的循環伏安曲線，如圖3所示，圖中曲線(a)是空絲網印刷電極的表征圖，我們可以看出明顯的氧化還原峰；如圖中曲線(b)所示，當絲網印刷電極上修飾上四氧化三鐵-殼聚糖納米材料后，由于四氧化三鐵具有導電性，因此電流比空絲網印刷電極有所增大；如曲線(d)所示，在此基礎上又修飾了有序介孔碳-殼聚糖材料后，因為有序介孔碳也具有良好導電性，所以電流明顯增大；當固定0.02 U的乙酰膽堿酯酶5 yL后，由于酶是大分子蛋白質，它不但不導電，而且還會阻礙界面的電子傳遞，所以電流峰值變小，如曲線(C)所示，這也證明了乙酰膽堿酯酶已經成功的固定到電極表面；
3)空絲網印刷電極和修飾了不同材料的電極在含1.0 mmol/L氯化硫代乙酰膽堿(ATCl)的pH 7.5 PBS中的循環伏安圖如圖4所示，掃描速率為50 mV/s。與圖3作對比可以看出，當底液中含有ATCl時，AChE/0MC-CS/Fe304-CS/SPCE電極的循環伏安曲線的電流峰有了明顯的增大，如曲線(d)所示，說明電流的產生是在乙酰膽堿酯酶的催化作用下，ATCl的水解產生電活性物質硫代膽堿的氧化而形成的。
[0019]實施例3試驗條件的優化
O pH值得優化
測試底液PH值得不同，對乙酰膽堿酯酶的活性有不同的影響，進而會影響AChE/0MC-CS/Fe304
-CS/SPCE傳感器的靈敏度，所以，本實驗制備了一系列pH值的磷酸鹽緩沖液，pH值分別為 6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0，并分別配成了一系列的 1.0 mmol/L ATCl 底液。圖 5顯示的是0MC-CS/Fe304_CS/SPCE傳感器在不同pH值底液中滴加乙酰膽堿酯酶前后進行的循環伏安法測定的電流差值的大小(滴加0.02 U的乙酰膽堿酯酶5 μ L)。從圖中可以看出，當pH值為8.0時，差值最大，這表明，pH為8.0是該傳感器的最優pH值，此時，酶能夠更好地催化底物產生電活性物質；
2)酶固定量的優化
AChE固定在電極表面的量也是影響生物傳感器電流響應的重要因素之一。圖6顯示的是0MC-CS/Fe304_CS/SPCE傳感器滴加不同量的乙酰膽堿酯酶后，與未滴加乙酰膽堿酯酶的電極在1.0 mmol/L ATCl (pH8.0)底液中進行循環伏安測試產生的電流的變化大小。本試驗分別向不同的電極負載酶的量分別是0.02 U、0.04 U、0.06 U、0.08 U,0.1 U、0.12 U、
0.14 U0如圖所示，在一定范圍內電流的變化隨酶負載量的增大而增大，當酶負載量為0.1U時，電流的變化最大，之后隨著負載量的增大而基本保持不變，說明電極表面固定的酶量已經達到飽和。因此，在今后的試驗中，選擇乙酰膽堿酯酶的負載量為0.1 U;
3)孵化時間的優化
農藥與傳感器的接觸時間(孵化時間)也影響電流的響應，農藥抑制酶活性，致使酶催化底物產生的電活性物質變少，因此電流值明顯變小，所以本次試驗分別對不同孵化時間的電極進行了檢測，將AChE/0MC-CS/Fe304-CS/GCE于同一濃度的甲胺磷農藥孵化時間分別控制為2 min、4 min、6 min、8 min、10 min、12 min、14 min，如圖7所示，隨著孵化時間的增加，電流的變化量隨之增加，但當孵化時間超過12 min時，電流變化量基本不變，這可能是農藥與酶的活性位點結合已達到飽和，所以，最優孵化時間選擇12 min。
[0020]實施例4利用所制備的電流型乙酰膽堿酯酶傳感器的應用
1)傳感器穩定性的檢驗
傳感器的穩定性通過組間偏差試驗進行研究，用相同的方法在10根絲網印刷電極上制作了 AChE/0MC-CS/Fe304_CS/SPCE 傳感器，測定了 40 ng/mL 和 400 ng/mL 的甲胺磷農藥，其相對偏差分別為3.6%和2.9%，說明AChE/0MC-CS/Fe304_CS/SPCE傳感器具有良好的穩定再現性；
2)農藥濃度與抑制率間的線性關系配置了一系列濃度的甲胺磷和毒死蜱標準溶液，將上述乙酰膽堿酯酶傳感器浸入到不同濃度的農藥標準溶液中12min，然后在反應池中加入含有LOmM氯化硫代乙酰膽堿(ATCl)的磷酸鹽緩沖溶液，進行差分脈沖伏安掃描，抑制率I可由下式求得:
I (%) - (Ipj control-1 P1 exp)/lp, control ^ 100%
其中Ip1 _&￡11和I P1 分別為修飾電極未經過農藥抑制和經過農藥抑制后的電流。圖8所示為AChE/0MC-CS/Fe304-CS/SPCE傳感器被不同濃度甲胺磷農藥抑制后在含有1.0mmol/LATCI的pH為8.0的磷酸鹽緩沖液中差分脈沖伏安曲線，甲胺磷濃度:a_k: O μ g/L; I μ g/L; 10 μ g