一種基于絲網印刷電極檢測有機磷農藥的傳感器的制備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種基于絲網印刷電極檢測有機磷農藥的傳感器的制備方法及應用，屬于生物傳感器技術領域。
技術背景
[0002]我國是蔬菜生產和消費大國。病蟲害是影響蔬菜產量的主要因素之一，每年有20%以上的蔬菜損失是因為病蟲害導致的，為了確保農業增產和農民增收，在蔬菜種植過程中會使用大量的農藥，平均一年施藥達26次之多。我國使用的殺蟲劑有70%是有機磷農藥，有機磷農藥毒性大、觸殺面廣，引起的中毒事故非常突出。我國加入世貿組織之后，因為不符合歐美等發達國家的相關農產品進口標準，生產的勞動密集型產品，例如茶葉、糧食等農產品屢屢遭到退貨、銷毀、暫停進口的處理。要避免上述情況的發生，除了從源頭上控制農藥的使用外，及時、準確地檢測出蔬菜中的農藥殘留量是保障農產品安全的重要環節。
[0003]傳統的農藥殘留檢測方法有氣相色譜法、高效液相色譜法、質譜法、氣質聯用儀等，但這些檢測方法使用的儀器價格昂貴，需對樣品進行繁瑣的分離、提取、衍生化等預處理步驟，耗時、成本高，而且存在有機溶劑污染環境等問題，需要專業技術人員維護，不適用于現場檢測。乙酰膽堿酯酶(AChE)生物傳感器是通過檢測接觸農藥前后酶催化底物產生電流的變化來測定農藥濃度，易于實現檢測儀器的便攜和在線檢測，且操作簡單分析速度快，可用于農藥殘留的現場檢測。絲網印刷電極輕巧，攜帶方便，可一次性使用，將絲網印刷電極用于乙酰膽堿酯酶生物傳感器，更加適合于農藥殘留的快速檢測。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種能夠克服傳統檢測技術的不足，具有操作簡單、成本低廉、檢測靈敏度高等優點的乙酰膽堿酯酶生物傳感器的制備及應用。采用技術方案如下:
一種基于絲網印刷電極檢測有機磷農藥的傳感器的制備方法及應用，其特征在于，是在清洗活化后的絲網印刷電極表面先后修飾上制備的納米四氧化三鐵-殼聚糖的復合物和有序介孔碳-殼聚糖的復合物，然后在修飾好的電極上滴加乙酰膽堿酯酶，得到檢測有機磷農藥的乙酰膽堿酯酶生物傳感器。
[0005]所述方法步驟如下:
O納米四氧化三鐵-殼聚糖復合物和有序介孔碳-殼聚糖復合物的制備；
2)清洗活化絲網印刷電極，得到預處理的絲網印刷電極；
3)將步驟I)制備得到的納米四氧化三鐵-殼聚糖復合物和有序介孔碳-殼聚糖復合物先后修飾到步驟2)預處理的絲網印刷電極上，得到修飾好的絲網印刷電極；
4)將乙酰膽堿酯酶滴加到步驟3)所得的修飾好的絲網印刷電極上，自然晾干后得到基于絲網印刷電極的乙酰膽堿酯酶生物傳感器； 5)優化步驟4)所得的乙酰膽堿酯酶生物傳感器的三種試驗條件；
6)在步驟5)所得的最優條件下，對甲胺磷和毒死蜱進行檢測。
[0006]所述方法，其特征在于，步驟I)所述納米四氧化三鐵-殼聚糖復合物和有序介孔碳-殼聚糖復合物分別是以殼聚糖為分散劑，分散納米四氧化三鐵和有序介孔碳，得到的分散均勻的懸濁液。
[0007]所述方法，其特征在于，步驟3)所述絲網印刷電極電極的修飾，是先將8 μ L納米四氧化三鐵-殼聚糖復合物滴加到預處理的絲網印刷電極上，室溫下晾干后，再滴加上8μ L有序介孔碳-殼聚糖復合物，室溫下晾干，得到四氧化三鐵-殼聚糖/介孔碳-殼聚糖修飾的絲網印刷電極。
[0008]所述方法，其特征在于，步驟4)所述在修飾好的電極上滴加乙酰膽堿酯酶，是將5μ L 0.02U/ μ L的乙酰膽堿酯酶滴加到四氧化三鐵-殼聚糖/介孔碳-殼聚糖修飾好的絲網印刷電極上，在4°C條件下干燥，得到乙酰膽堿酯酶生物傳感器。
[0009]所述方法，其特征在于，步驟5)所述乙酰膽堿酯酶生物傳感器的三種試驗條件測試底液PH值、乙酰膽堿酯酶固定量、孵育時間進行了優化:pH值為8.0，乙酰膽堿酯酶固定為0.1 U，孵育時間為12 Hiin0
[0010]所述方法，其特征在于，具體步驟如下:
O納米四氧化三鐵-殼聚糖復合物和有序介孔碳-殼聚糖復合物的制備:稱取0.5 g殼聚糖(CS)置于燒杯中，加入1.0 %的醋酸溶液攪拌溶解，將溶解好的溶液置于250 mL容量瓶中并定容，定容后的溶液倒入燒杯中，在磁力攪拌器下磁力攪拌10 h，得到0.2%的殼聚糖溶液；取納米四氧化三鐵(Fe3O4)顆粒2 mg，分散于4 mL 0.2%的殼聚糖溶液中，在超聲波清洗機中超聲至分散均勾，得到0.5 mg/mL納米四氧化三鐵-殼聚糖復合物；取2 mg有序介孔碳(OMC)溶于4 ml的0.2%殼聚糖溶液中，在超聲波清洗機中超聲I小時得到均一、淺黑色的懸濁液，即為0.5 mg/mL有序介孔碳-殼聚糖復合物；
2)絲網印刷電極的清洗、活化:首先，將絲網印刷碳電極放入盛有ImMNaOH溶液的小燒杯中超聲清洗5分鐘，超純水清洗，氮氣吹干，然后，將電極放入盛有ImM HCl溶液的小燒杯中超聲清洗5分鐘，超純水清洗，氮氣吹干，之后，用無水乙醇清洗電極，氮氣吹干，最后，在pH=5的磷酸鹽緩沖液中進行電流-時間曲線掃描300s，之后，進行循環伏安曲線掃描，直至性能穩定；
3)絲網印刷電極的修飾:在絲網印刷電極上滴加8μ L 0.5 mg/mL的四氧化三鐵-殼聚糖溶液，在室溫下放置自然干燥，得到四氧化三鐵-殼聚糖電極，接著在滴加過四氧化三鐵-殼聚糖溶液的電極上滴加8 μ L 0.5 mg/mL的介孔碳-殼聚糖溶液，在室溫條件下放置自然干燥，得到四氧化三鐵-殼聚糖/介孔碳-殼聚糖電極；
4)乙酰膽堿酯酶的固定:在上述的電極上滴加5μ L 0.02 U的乙酰膽堿酯酶(AChE)，在4°C條件下干燥，得到乙酰膽堿酯酶生物傳感器，并將制備好的電極放于4 °(:干燥的環境中保存備用；
5)試驗條件的優化:制備一系列pH值的磷酸鹽緩沖液，pH值分別為6.0,6.5,7.0,7.5、8.0、8.5、9.0，并分別配成了一系列的1.0 mmol/L硫代乙酰膽堿(ATC1)底液，在這些底液中對傳感器電流值進行檢測，篩選出最佳pH值8.0 ;分別向電極負載0.02 U,0.04 U、0.06U,0.08 U、0.1 U、0.12 U、0.14 U的酶量，對其電流值進行檢測，篩選出最佳酶負載量為0.1U;用同一濃度的農藥孵育時間分別控制為2 min、4 min、6 min、8 min、10 min、12 min、14min，對其電流值進行檢測，篩選出最佳孵育時間為12 min ；
6)農藥的檢測:在最優條件下:pH 8.0，酶負載量0.1 U，孵育時間12 min，對不同濃度的甲胺磷和毒死蜱進行電流檢測，并分別建立了農藥濃度與抑制率之間的線性關系，得不同濃度的甲胺磷農藥的對數值與農藥的抑制率之間的線性回歸方程為y=21.843x-0.2084，相關系數為0.9928，不同濃度的甲胺磷農藥的對數值與農藥的抑制率之間的線性回歸方程為 y=7.7421x+16.607，相關系數為 0.9957。
[0011]所述方法，其特征在于，蔬菜中農藥殘留具體檢測步驟如下:
1)蔬菜樣品的前處理:從當地超市購買新鮮的白菜、油菜、生菜，去掉葉片上的泥土和灰塵，并清洗干凈，室溫下晾干，然后，分別將蔬菜切成3 X 3 _的小葉片，稱取2.0 g蔬菜樣品于小燒杯中，加入I mL的丙酮和9 mL的0.1 M的磷酸鹽緩沖液(pH = 7.5)。將樣品混合液在超聲波清洗儀中超聲15 min,然后將懸浮液置于離心管中，用離心機離心(10min, 2000 rpm)，取上清液備用；
2)樣品的檢測:在最優條件下:pH8.0，酶負載量0.1 U，孵育時間12 min，對蔬菜樣品進行檢測；
3)根據建立的相應的線性關系，計算出相應樣品的農藥殘留量。
[0012]所述方法，其特征在于，用于檢測有機磷類農藥。
[0013]所述方法，其特征在于，所用電極為絲網印刷電極，包括一印制電極的基片、基片上印制的外部絕緣層和三根電極引線，其特征在于所述的基片上還印制有三個電極，一個工作電極:碳電極；一個對電極:碳電極，直徑3mm ;和一個參比電極:Ag/AgCl電極，各電極對應連接有一電極引線，該電極電化學性能穩定，均一性好，后面的說明中，該絲網印刷電極簡寫為SPCE。
[0014]所述方法，其特征在于，采用本發明制備的基于絲網印刷電極檢測有機磷農藥的傳感器具有操作簡單、成本低廉、檢測靈敏度高等優點且反應時間短，樣品和試劑消耗量少，穩定性高，可用于實際樣品的現場檢測，符合我國農藥殘留快速檢測技術發展和國際化要求。
【附圖說明】
[0015]圖1和圖2為OMC-CS的SEM圖
圖 3 AChE/0MC-CS/Fe304_CS/SPCE 傳感器組裝過程中含 0.1 mol/L KCl