；組裝后，獲得檢測用試紙條。
[0028]4)檢測程序和結果判定
[0029]試紙條平放，將被測樣品滴加到試紙條的樣品墊上，5-10min內觀察結果，如果檢測線和質控線均出現紅線，則為陽性結果；如果檢測線未出現紅線，質控線出現紅線，則為陰性結果；如果檢測線和質控線均未出現紅色，則檢測結果無效。
[0030]所述膠體金墊上包被有單增李斯特菌菌體蛋白抗體，檢測線包被的單增李斯特菌菌體蛋白抗體為不同于膠體金墊包被的另一種單增李斯特菌菌體蛋白抗體，質控線包被的蛋白為羊抗兔IgG。
[0031]所述牛血清白蛋白作為封閉劑用于膠體金探針的制備和NC膜的處理。
[0032]實施例
[0033]1、膠體金的制備:將Ig氯金酸，購自北京鼎國生物技術有限公司，定容至10ml水溶液中，配制I %氯金酸溶液；取Iml的I %氯金酸溶液定容至10ml水溶液中，配制0.01 %氯金酸溶液；取0.01%氯金酸溶液25ml加入到硅化后的三角瓶中，置于磁力攪拌器上加熱，待溶液沸騰穩定后，迅速加入新鮮配制的1%檸檬酸三鈉水溶液Iml作為還原劑，繼續攪拌加熱直至溶液顏色變為穩定的透明紅色，冷卻后加去離子水補充至25ml，制備獲得膠體金溶液，置于棕色瓶中4°C備用。
[0034]2、膠體金探針的制備:用0.2mol/L的碳酸鉀溶液將膠體金溶液的pH值調至8.0，逐滴加入單增李斯特菌菌體蛋白抗體，購自abeam公司，至單增李斯特菌菌體蛋白抗體濃度為20yg/mL，緩慢搖勻15min，室溫放置1min ;加入終濃度為1%的牛血清白蛋白，購自北京鼎國生物技術有限公司，作為封閉劑，形成抗體-膠體金標記物。
[0035]3、膠體金探針的純化:將標記的膠體金溶液以4000r/min離心20min，棄去沉淀，收集上清液；將收集到的上清液13000r/min離心50min，棄上清；得到的沉淀用原體積1/10的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液重懸，得到抗體_膠體金標記物的復溶液，滴加在玻璃纖維膜上，購自上海金標生物科技有限公司，制備膠體金墊，37°C烘干后用于試紙條的組裝。
[0036]4、NC膜上檢測線和質控線的包被:用含有1%牛血清白蛋白的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液浸泡NC膜，其中NC膜購于Millipore公司，30min后取出，37°C烘干后備用；在檢測線和質控線位置分別包被lmg/ml單增李斯特菌菌體蛋白抗體，購自上海遠慕生物科技有限公司，lmg/ml羊抗兔二抗，購自索萊寶科技有限公司，置于37°C烘箱中干燥6h。
[0037]5、試紙條的組裝工藝:如圖1所示，上部為俯視圖，下部為平視圖。膠體金試紙條包括PVC板1，樣品墊2、膠體金墊3，檢測線4，質控線5，NC膜6，吸水墊7，其中PVC板、樣品墊和吸水墊均購自上海金標生物科技有限公司；組裝時將樣品墊2和膠體金墊3附著于NC膜6的一端，吸水墊7附著于NC膜6的另一端，檢測線4位于膠體金墊3和質控線5的中部，在檢測線上固定有單增李斯特菌菌體蛋白抗體，在質控線上固定有羊抗兔IgG。首先將NC膜6粘附于PVC板I上，PVC板I上由左至右粘附有樣品墊2、包被有金標記的單增李斯特菌菌體蛋白抗體的膠體金墊3、NC膜6和吸水墊7 ;樣品墊2的一端在膠體金墊3的一端上方，膠體金墊3的另一端在NC膜6的上方。
[0038]6、結果判定:圖2為將試紙條平放后的俯視圖，將模擬帶菌樣品滴加到試紙條左側的樣品墊2上，5-10min內觀察結果，檢測線4和質控線5均出現紅色，判定為陽性。
【主權項】
1.一種基于膠體金試紙條的單增李斯特菌檢測方法，該檢測方法所使用器材包括有PVC板、樣品墊、包被有李斯特菌菌體蛋白抗體的膠體金墊、帶有檢測線和質控線的NC膜、吸水墊；檢測方法包括以下步驟: 1)膠體金溶液的制備 將0.01%氯金酸水溶液25mL加入到三角瓶中，置于磁力攪拌器上加熱至沸騰穩定后，加入還原劑檸檬酸三鈉水溶液，繼續攪拌加熱直至溶液顏色變為透明紅色，冷卻后加去離子水補充至原體積，制備獲得的膠體金溶液用于單增李斯特菌菌體蛋白抗體的標記； 2)膠體金探針的制備 將上述膠體金溶液的PH值調整至8.0-9.0，向其中逐滴加入單增李斯特菌菌體蛋白抗體，至終濃度在10-30 μ g/mL，緩慢搖勻；加入1% -2%的牛血清白蛋白，繼續混合均勻；通過差速離心，收集抗體-膠體金標記物，將純化后的抗體-膠體金標記物用磷酸鹽緩沖液溶解，制備獲得的膠體金探針置溫度為4°C保存； 3)試紙條的制備和組裝 將純化后的膠體金探針涂布在玻璃纖維膜上，干燥后備用；將帶有檢測線和質控線的NC膜用含有1% -2%的牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液處理后備用；將單增李斯特菌菌體蛋白抗體包被在NC膜上，作為檢測線；將羊抗兔IgG蛋白包被在NC膜上，作為質控線，干燥后備用；組裝時，在PVC板上粘貼NC膜；在帶有檢測線和質控線的NC膜兩端分別放置吸水墊和膠體金墊，吸水墊和膠體金墊均與NC膜部分重疊；緊鄰包被有單增李斯特菌菌體蛋白抗體的膠體金墊粘貼樣品墊，樣品墊與膠體金墊部分重疊；組裝后，獲得檢測用試紙條； 4)檢測程序和結果判定 試紙條平放，將被測樣品滴加到試紙條的樣品墊上，5-10min內觀察結果，如果檢測線和質控線均出現紅線，則為陽性結果；如果檢測線未出現紅線，質控線出現紅線，則為陰性結果；如果檢測線和質控線均未出現紅色，則檢測結果無效。2.根據權利要求1所述基于膠體金試紙條的單增李斯特菌檢測方法，其特征是:所述膠體金墊上包被有單增李斯特菌菌體蛋白抗體，檢測線包被的單增李斯特菌菌體蛋白抗體為不同于膠體金墊包被的另一種單增李斯特菌菌體蛋白抗體，質控線包被的蛋白為羊抗兔IgG03.根據權利要求1所述基于膠體金試紙條的單增李斯特菌檢測方法，其特征是:所述牛血清白蛋白作為封閉劑用于膠體金探針的制備和NC膜的處理。
【專利摘要】本發明基于膠體金試紙條的單增李斯特菌檢測方法，該檢測方法所使用器材包括有PVC板、樣品墊、包被有李斯特菌菌體蛋白抗體的膠體金墊、帶有檢測線和質控線的NC膜、吸水墊；檢測方法包括以下步驟：膠體金溶液的制備；膠體金探針的制備；試紙條的制備和組裝；檢測程序和結果判定。本發明的效果是該方法避免了在膠體金墊和檢測線上使用相同蛋白所可能造成的假陽性的出現。應用雙抗夾心法的原理檢測樣品中的單增李斯特菌，減少交叉反應的發生，增強特異性，操作簡便，5-10min內觀察結果，可實現現場樣本快速檢測。該方法與單克隆抗體相比，省去了雜交瘤細胞的融合和篩選過程，減少了制備周期和成本。
【IPC分類】G01N33/569, G01N33/532
【公開號】CN105203758
【申請號】CN201510612517
【發明人】劉珊娜, 王瑩, 劉金福, 孟繁桐, 范志華
【申請人】天津市德恒科技有限公司, 天津農學院
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年9月21日