基于膠體金試紙條的單增李斯特菌檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物檢測技術領域，特別是涉及一種基于膠體金試紙條的單增李斯特菌檢測方法。
【背景技術】
[0002]防止微生物引起的食品腐敗和食源性疾病是食品安全的重要課題也是食品加工和保藏的關鍵環節。在過去的20年間，全球食源性感染率出現顯著增長，沙門氏菌(Salmonella spp.)、志賀氏菌(Shigella spp.)和單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)已成為世界范圍內最主要的三種食源性致病菌。單增李斯特菌是一種兼性厭氧的革蘭氏陽性短桿菌，存在于土壤、污水、植物、人畜糞便和污染的食品中。該菌可以在很廣的溫度范圍內生長，對PH值、鹽濃度、冷凍和干燥條件也有一定程度的耐受性。單增李斯特菌可以存在于多種未經加工和加工過的食品中，容易污染的食品類型包括魚和海產品(19.4%)，生香腸(6.3%)，奶酪(5.5% )，加工的肉制品(4.5%)等。該菌主要是通過污染的食品進入人畜體內，對孕婦、新生兒、老年人和免疫功能低下的人威脅較大。
[0003]目前單增李斯特菌的國標檢測方法周期長，精度低，檢測步驟也較為復雜，不太適于食品衛生的常規快速檢驗。分子生物學方法由于熒光標記種類和儀器檢測通道限制等原因，不適合大量致病菌檢測的需要。膠體金檢測方法基于抗原抗體反應的免疫學原理，以膠體金作為示蹤標志物進行標記，操作簡單，時間短，可在同一時間內檢測大量樣品。利用膠體金試紙對單增李斯特菌進行快速檢測，可以作為常規方法的有益補充，用于現場樣品的初篩。
【發明內容】
[0004]針對上述存在的技術問題，本發明的目的是提供一種基于膠體金試紙條的單增李斯特菌檢測方法，用于快速簡便地檢測樣品中的單增李斯特菌。采用雙抗原夾心法將針對單增李斯特菌的特異性抗體蛋白包被于NC膜的檢測線上，用膠體金標記另一種單增李斯特菌抗體蛋白，用以檢測樣品中的單增李斯特菌。
[0005]為實現上述目的，本發明采用的技術方案是提供基于膠體金試紙條的單增李斯特菌檢測方法，該檢測方法所使用器材包括有PVC板、樣品墊、包被有李斯特菌菌體蛋白抗體的膠體金墊、帶有檢測線和質控線的NC膜、吸水墊；檢測方法包括以下步驟:
[0006]I)膠體金溶液的制備
[0007]將0.01 %氯金酸水溶液25mL加入到三角瓶中，置于磁力攪拌器上加熱至沸騰穩定后，加入還原劑檸檬酸三鈉水溶液，繼續攪拌加熱直至溶液顏色變為透明紅色，冷卻后加去離子水補充至原體積，制備獲得的膠體金溶液用于單增李斯特菌菌體蛋白抗體的標記。
[0008]2)膠體金探針的制備
[0009]將上述膠體金溶液的pH值調整至8.0-9.0，向其中逐滴加入單增李斯特菌菌體蛋白抗體，至終濃度在10-30 μ g/mL，緩慢搖勻；加入1% -2%的牛血清白蛋白，繼續混合均勻；通過差速離心，收集抗體-膠體金標記物，將純化后的抗體-膠體金標記物用磷酸鹽緩沖液溶解，制備獲得的膠體金探針置溫度為4°C保存。
[0010]3)試紙條的制備和組裝
[0011]將純化后的膠體金探針涂布在玻璃纖維膜上，干燥后備用；將帶有檢測線和質控線的NC膜用含有1%-2%的牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液處理后備用；將單增李斯特菌菌體蛋白抗體包被在NC膜上，作為檢測線；將羊抗兔IgG蛋白包被在NC膜上，作為質控線，干燥后備用；組裝時，在PVC板上粘貼NC膜；在帶有檢測線和質控線的NC膜兩端分別放置吸水墊和膠體金墊，吸水墊和膠體金墊均與NC膜部分重疊；緊鄰包被有單增李斯特菌菌體蛋白抗體的膠體金墊粘貼樣品墊，樣品墊與膠體金墊部分重疊；組裝后，獲得檢測用試紙條。
[0012]4)檢測程序和結果判定
[0013]試紙條平放，將被測樣品滴加到試紙條的樣品墊上，5-10min內觀察結果，如果檢測線和質控線均出現紅線，則為陽性結果；如果檢測線未出現紅線，質控線出現紅線，則為陰性結果；如果檢測線和質控線均未出現紅色，則檢測結果無效。
[0014]本發明的效果是:在膠體金墊上結合一種單增李斯特菌菌體蛋白抗體作為捕捉抗體，在NC膜檢測線上包被另一種單增李斯特菌菌體蛋白抗體作為檢測抗體，用抗標記抗體的多抗包被質控線作為質控抗體。本發明避免了在膠體金墊和檢測線上使用相同蛋白所可能造成的假陽性的出現。應用雙抗夾心法的原理檢測樣品中的單增李斯特菌，減少交叉反應的發生，增強特異性，操作簡便，5-10min內觀察結果，可實現現場樣本快速檢測。此外，單增李斯特菌菌體蛋白抗體可通過實驗室制備或購買商業化產品；與單克隆抗體相比，省去了雜交瘤細胞的融合和篩選過程，減少了制備周期和成本。與ELISA或PCR方法相比，利用試紙條檢測時無需使用儀器設備，便于操作。
【附圖說明】
[0015]圖1為本發明試紙條結構示意圖；
[0016]圖2為本發明實施例中單增李斯特菌膠體金檢測試紙條的模擬帶菌檢測結果。
[0017]圖中:
[0018]1、PVC板 2、樣品墊3、膠體金墊 4、檢測線
[0019]5、質控線 6、NC膜 7、吸水墊
【具體實施方式】
[0020]結合附圖對本發明的基于膠體金試紙條的單增李斯特菌檢測方法進一步說明。
[0021]本發明的基于膠體金試紙條的單增李斯特菌檢測方法，該檢測方法所使用器材包括有PVC板、樣品墊、包被有李斯特菌菌體蛋白抗體的膠體金墊、帶有檢測線和質控線的NC膜、吸水墊；檢測方法包括以下步驟:
[0022]I)膠體金溶液的制備
[0023]將0.01%氯金酸水溶液25mL加入到三角瓶中，置于磁力攪拌器上加熱至沸騰穩定后，加入還原劑檸檬酸三鈉水溶液，繼續攪拌加熱直至溶液顏色變為透明紅色，冷卻后加去離子水補充至原體積，制備獲得的膠體金溶液用于單增李斯特菌菌體蛋白抗體的標記。
[0024]2)膠體金探針的制備
[0025]將上述膠體金溶液的pH值調整至8.0-9.0，向其中逐滴加入單增李斯特菌菌體蛋白抗體，至終濃度在10-30 μ g/mL,緩慢搖勻；加入1% -2%的牛血清白蛋白，繼續混合均勻；通過差速離心，收集抗體-膠體金標記物，將純化后的抗體-膠體金標記物用磷酸鹽緩沖液溶解，制備獲得的膠體金探針置溫度為4°C保存。
[0026]3)試紙條的制備和組裝
[0027]將純化后的膠體金探針涂布在玻璃纖維膜上，干燥后備用；將帶有檢測線和質控線的NC膜用含有1%-2%的牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液處理后備用；將單增李斯特菌菌體蛋白抗體包被在NC膜上，作為檢測線；將羊抗兔IgG蛋白包被在NC膜上，作為質控線，干燥后備用；組裝時，在PVC板上粘貼NC膜；在帶有檢測線和質控線的NC膜兩端分別放置吸水墊和膠體金墊，吸水墊和膠體金墊均與NC膜部分重疊；緊鄰包被有單增李斯特菌菌體蛋白抗體的膠體金墊粘貼樣品墊，樣品墊與膠體金墊部分重疊