x和報告子肽R可 以隨機排列，只要其通過裂解位點（例如，蛋白水解位點）鍵聯。
[0152] 圖14中所示的多肽含有三種重同位素標記的肽（A*plex、B*plex和Oplex)，其 對應于靶肽A、B和C，鍵聯到報告子肽R，還含有重同位素標記。其它實施例是可能的，其中 R不含有重同位素標記或含有一種或多種允許多種獨特報告子同位素物在復用測定中對多 種獨特內標肽進行定量的同位素物。其它【具體實施方式】是可能的，其含有各種數目（η)的 標記肽和其對應于一種或多種革G肽的同位素物，與一種或多種報告子肽和同位素物連接。η 的范圍例如由如本領域技術人員已知的制造可行性、溶解度等決定。在一個【具體實施方式】 中，至多99的η值是可能的。在一個【具體實施方式】中，至多49的η值是可能的。在一個具 體實施方式中，η = 4。在一個【具體實施方式】中，η = 5。在一個【具體實施方式】中，η = 6。在 一個【具體實施方式】中，η = 7。在一個【具體實施方式】中，η = 8。在一個【具體實施方式】中，η =9。在一個【具體實施方式】中，η =10。在一個【具體實施方式】中，η =11。在一個具體實施 方式中，η = 12。在同位素物的情況下，這些限制顯著增加；可以使用不同重氨基酸、同位素 偏移和同位素物的組合。
[0153] 通用報告子肽U和報告子肽R可以經設計以具有不同序列和同位素物以用于復用 定量。通過肽序列測定的質量差異組合的數目是有限的。當待定量的肽的數目超過可用于 報告子肽R的質量差異組合的最大數目時，可以使用通用報告子肽U的額外同位素物，并且 可以使用額外序列：例如U 1、U2、……ΙΓ，其中η僅受可以通過儀器同時定量的肽的數目限 制。作為一個實例，多肽A*-Rplex可以具有氨基酸序列TTVSKTETSQVAPA SEQ ID NO. 3,肽 A*具有序列TETSQVAPA SEQ ID NO. 4,并且報告子肽Rplex具有序列TTVSK SEQ ID NO. 5 的圖6的可分辨賴氨酸同位素物，如W0/2003/046148中所公開。
[0154] 因為通用報告子肽Uplex同位素物集合的序列不受約束或限制，并且因為通用 報告子肽Uplex同位素物集合是可以容易排序、儲備、維持和存儲的產品，所以其使用向 MS肽定量提供了靈活性。在一個【具體實施方式】中，通用報告子肽Uplex同位素物集合的 序列可以經定制以最小化肽、多肽或蛋白質與例如容器、端部、管道等的非特異性結合，通 過選擇具有低疏水性指數的序列，例如PVVVPR SEQ ID NO. 1，其疏水性指數是13. 45,或 SSAAPPPPPR(SEQ ID NO. 2)，其疏水性指數是7. 57 ;并且使用多種精氨酸同位素物或其它重 氨基酸前體的同位素物（圖9、10a_b)。在一個【具體實施方式】中，通用報告子肽Uplex同位 素物集合的序列可以經定制以最大化多肽A*plex-R的溶解度。舉例來說，因為使用通用 報告子肽U，所以多肽A*plex-R不必在MS分析之前精確定量，并且在合成中使用以確定比 例預混合的同位素物提供了跨越稀釋曲線的多個數據點以便改良定量。這導致產生多肽 A*plex-R的制造時間更短并且成本更低。肽A*plex在極低濃度下定量，在所述濃度下保證 其溶解度，導致精密度和可重復性增強。
[0155] 因為肽A*plex的定量在用于對報告子肽R進行定量的相同儀器上并且在相同 MS程序內進行，所以其始終反映了添加到樣品中的量，并且與在MS定量之前的樣品制備、 分級和液相色譜分離期間的多肽A*plex-R的最終變化、降解和部分損耗無關。當擴展TO 03/016861中所述的方法時，A*plex同位素物集合以在不稀釋的情況下過高而無法使用的 已知濃度提供；因此，典型地將其稀釋1000到10, 〇〇〇倍。如果A*plex的序列是相對疏水 性的并且傾向于是非特異性結合的，那么與β -類淀粉肽的情況一樣，大量標準物將在稀 釋期間損耗。這降低了方法的精密度。因為通用報告子肽Uplex同位素物集合的序列可以 經設計和優化以減少非特異性結合，所以通用報告子肽U的稀釋傾向于不是顯著非特異性 結合的。通用報告子肽Uplex同位素物集合包括在待定量的樣品中，并且在稀釋的樣品中 對報告子肽R進行定量，因此標準物（例如，β -類淀粉肽）的非特異性結合將不會降低方 法的精密度。
[0156] 多肽A*plex-R是蛋白質P的假替代，并且可以用以監測裂解（例如，蛋白水解消 化）。其可以用以定量和比較樣品與樣品和/或實驗與實驗消化效率，因為由確定同位素物 集合提供的稀釋曲線提供了跨越廣泛動態范圍的準確定量。其可以用以使來自樣品與樣品 和/或實驗與實驗的結果標準化。
[0157] 在一個【具體實施方式】中，本發明方法適于使用通過可裂解位點綴合到報告子肽R 或其它部分的蛋白質型肽對分析物（包括但不限于肽、多肽和蛋白質）進行MS定量。這 在圖16中對于任何分析物示意性地展示，并且在圖17中對于肽分析物示意性地展示。重 蛋白質型肽同位素物集合含有與天然蛋白質型肽相同的氨基酸序列，但含有不同的原子質 量。集合中的每種重蛋白質型肽同位素物都與報告子肽R具有等摩爾濃度。在一個具體實 施方式中，報告子肽R用重同位素或同位素物的集合標記。在一個【具體實施方式】中，報告子 肽R不用重同位素標記。通用報告子肽U具有與報告子肽R相同的序列。通用報告子肽U 具有與報告子肽R不同的質量，因為其含有重同位素物集合。僅對通用報告子肽Uplex進 行定量。在裂解（例如，蛋白水解消化）之后，以等摩爾濃度將重蛋白質型肽或同位素物集 合和報告子肽R釋放到樣品中。使用重通用報告子肽Uplex同位素物集合的量測定報告子 肽R的量。
[0158] 通用報告子肽Uplex同位素物集合是序列非依賴性的并且用作定量標準物和裂 解標準物。通用報告子肽Uplex同位素物集合具有與報告子肽R相同但與待測定的蛋白質 無關的肽序列。因為通用報告子肽Uplex同位素物集合和報告子肽R的序列相同，所以使 用重標記的報告子肽R和重標記的通用報告子肽Uplex同位素物集合獲得通用報告子肽 Uplex同位素物集合與報告子肽R之間的原子質量差異。通過在報告子肽R和通用報告子 肽Uplex同位素物集合中使用不同重標記，或通過在報告子肽R或通用報告子肽Uplex同 位素物集合中使用額外重氨基酸，獲得原子質量差異（圖15)。與通用報告子肽Uplex同位 素物集合相比，報告子肽R可以具有更低原子質量或更高原子質量。
[0159] 如圖18中所表示，用于命名組分的適宜規約如下：蛋白質型肽命名為字母，例如 A、B、C ;重同位素標記的蛋白質型肽命名為具有星號（說明書重同位素標記）和"plex" 后綴（以反映使用多種同位素物）的字母，例如A*plex、B*plex、Oplex ;R是報告子； Uplex是通用報告子同位素物集合；攜帶重同位素標記的氨基酸由度數符號" ° "和呈粗 體的一或三字母命名的常規氨基酸進行表示，例如R或Arg表示具有重同位素標記的氨基 酸精氨酸；攜帶重同位素物標記的集合的氨基酸由星號符號和呈粗體的一或三字母 命名的常規氨基酸進行表示，例如R*或Arg*表示具有一種或多種重同位素物標記的氨 基酸精氨酸；以商標HeavyP印tide IGNIS?市售的串接肽和通用報告子的一種組合物是 A*pIexB*pIexC*pIexR。
[0160] 在一個【具體實施方式】中，通用報告子肽Uplex同位素物集合的序列通過優化色譜 離子化和碎片化性質進行優化和/或定制以與蛋白質型肽的性質相容。作為一個實例，通 用報告子肽Uplex同位素物集合通過引入額外電荷或疏水性性質進行修飾以增強離子化 和/或去溶劑化。作為一個實例，通用報告子肽Uplex同位素物集合通過引入天冬氨酸-脯 氨酸（DP)基團進行修飾以增強碎片化，所述同位素物集合通過引入天冬氨酸-脯氨酸（DP) 基團含有高度易斷的鍵，所述鍵在串聯MS中在比其它二肽鍵更低的碰撞能下碎片化。作為 一個實例，通用報告子肽Uplex同位素物集合通過選擇具有與蛋白質型肽類似的疏水性因 子的報告子肽進行修飾，以在液相色譜上具有與蛋白質型肽類似的滯留時間。因此，通用 報告子肽Uplex同位素物集合可以通過設計進行優化。舉例來說，相同肽序列的質量組合 和同位素物的數目可以進行優化以增加復用能力，導致多達500種蛋白質能夠在單一測定 中被定量。但因為肽序列相同，所以同位素物的全集合可以在高MS分辨率下在MSl或MSn 水平下分辨，并且肽序列可以通過低MS分辨率下的MS/MS或MSn碎片化驗證，僅需要一個 稀釋曲線對通用報告子肽U進行定量。通過增加具有不同質量和同位素物的相同序列的數 目，可以在單一實驗中定量的蛋白質的數目增加，儀器使用和資源并不同時增加。
[0161 ] 在一個【具體實施方式】中，針對低特異性結合、高溶解度、高MS信號強度和/或所要 液相色譜滯留時間優化通用報告子肽Uplex同位素物集合。在一個【具體實施方式】中，通用 報告肽Uplex同位素物集合肽序列經修飾以改變其色譜滯留性質；這是內部修飾的一個實 例。在一個【具體實施方式】中，通用報告子肽Uplex同位素物集合結構通過連接標簽進行修 飾以改變其色譜滯留性質；這是外部修飾的一個實例。在一個【具體實施方式】中，通用報告子 肽Uplex同位素物集合結構通過連接本身已經經修飾的標簽而進行修飾以改變其色譜滯 留性質；這是外部修飾的另一個實例。
[0162] 在一個【具體實施方式】中，使用通用同位素物聚合物集合，其中聚合物廣泛定義為 單體的連接基團。單體不必是肽，或不必完全是肽，并且可以含有一種或多種同位素。在一 個【具體實施方式】中，多糖（即，聚糖單體）用作通用聚合物)。多糖是兩種或更多種 單糖通過糖苷鍵鍵聯的組合，并且多糖由單體的集合合成以便產生同位素異構體集合。所 述多糖的實例包括淀粉、纖維素和糖原的同位素物。其結構和合成是本領域中已知的。在 一個【具體實施方式】中，脫氧核糖核酸（DNA)或核糖核酸（RNA)同位素物集合用作通用聚合 物（#_)。其結構和合成是本領域中已知的。檢測和定量核苷酸的方法是明確的，例如 PCR、定量PCR。連接到分析物的核苷酸可以用作分析物的獨特標識（即，"條形碼"），并且 用于使用高分辨率MS用同位素物集合的同位素稀釋的定量目的。
[0163] 在一個實例中，下表中所示的以下肽序列（當前用作滯留時間校準肽）中的一者 的同位素物用作通用報告子肽Uplex同位素物集合。這些肽展現充足離子化并且具有確定 的洗脫性質。下文的下表展示其序列、疏水性和在Hypersil Gold C18柱上的色譜特性。
[0164]
CN 105143872 A ^ 以/38 貝
[0165] 使用用斯派瑟（Spicer)等人（2007).序列特異性滯留計算器 (Sequence-specific retention calculator)。反相HPLC中的肽滯留時間預測算法的家 族：對于各種色譜條件和柱的適用性（A family of peptide retention time prediction algorithms in reversed-phase HPLC:applicability to various chromatographic conditions and columns).《分析化學》79 (22) :8762-8中所述的算法進行的計算來測定 疏水性。
[0166] 在一個【具體實施方式】中，重同位素標記并入在C末端氨基酸中。舉例來說，使用肽 SSAAPPPPPR SEQ ID NO. 2,此【具體實施方式】可以表示為SSAAPPPPPR*，其中末端R含有作為 用高分辨率MS可分辨的同位素物的集合并入的重同位素標記。
[0167] 在一個【具體實施方式】中，重同位素并入在肽中除C末端以外的位置處。以下氨 基酸中的一者或多者可以用重同位素物集合標記：丙氨酸、精氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、 賴氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸（圖8)。這些氨基酸的質量偏移>4Da。另外，肽內的多種氨 基酸可以用同位素物集合標記，并且相同氨基酸可以用不同同位素標記，如精氨酸+6Da 和精氨酸+IODa同位素物集合，其將分別在低MS分辨率下和以累加復用能力在高分辨 率MS下引入6Da和IODa質量偏移（圖7a-b)。舉例來說，使用肽SSAAPPPPPR SEQ ID NO. 2,其中*表示含有重同位素標記的位置的氨基酸，以下位置是可能的：SSA*APPPPPR、 SSA*A*PPPPPR、SSA*A*P*PPPPR、SSA*A*P*P*PPPR、SSA*A*P*P*P*PPR、SSA*A*P*P*P*P*PR、 SSA*A*P*P*P*P*P*R、SSA*A*P*P*P*P*P*R*。此【具體實施方式】（其中重同位素物氨基酸位于 一個或多個位置處）允許相同報告子序列情況下的更高復用。
[0168] 對于復用測定，將定制肽一起組合到復雜革El向測定中。每種定制肽具有類似于定 制肽洗脫的不同相應通用報告子Uplex同位素物集合。這允許許多肽容易跨越LC梯度被復 用和定量而無交叉污染。舉例來說，復用分析陣列含有多種不同通用肽Uplex同位素物集 合，所述集合具有相同氨基酸序列但由于存在重同位素物或同位素物集合而具有不同原子 質量；和多種報告子肽R，每種報告子肽R可裂解地鍵聯到樣品中的待定量的不同同位素標 記的蛋白質型肽。通用肽Uplex同位素物集合具有與定制肽大體上類似的色譜滯留時間。 在一個【具體實施方式】中，通用報告子肽Uplex同位素物集合中的重同位素物標記在多種不 同氨基酸處并入。此【具體實施方式】提供了使用相同通用報告子肽Uplex氨基酸序列的更高 復用陣列。
[0169] 在一個【具體實施方式】中，通用報告子肽Uplex同位素物集合經定制以用于特定質 譜儀和/或特定用途以用于鑒別、表征和定量疾病生物標記物（蛋白質組研究、代謝組研 究、藥物蛋白質組研究）發現、確認、驗證和早期臨床診斷和疾病進展監測。舉例來說，4-10 氨基酸報告子肽將允許并入較少同位素物前體和高分辨率MS下的較低復用能力。備選地， 較大11-25氨基酸肽可以允許并入較多同位素物前體和高分辨率質譜儀下的較低復用能 力。蛋白質組研究已經通過在測定中并入內標物從鑒別（定性蛋白質組研究）發展到定量。 需要內標物，因為質譜中的所得峰高度或峰面由參數（例如，肽量、肽離子化、肽碎片化、離 子抑制等）的復雜函數產生。不存在從質譜峰的表面測量肽量的算法。當添加已知量的內 標物到待分析的肽中時，通過將其峰表面與內標物峰表面比較來測定肽的量。
[0170] -個【具體實施方式】是經標簽修飾的所描述的肽。用以修飾肽的這種標簽不同于分 別修飾通用報告子U和報告子R所需或任選的重同位素標記。然而，所述標簽可以是重同 位素物集合，如隨后在第一實例中所述。
[0171] 這種標簽的一個實例是重同位素物集合。這種標簽的一個實例是同位素物標簽。 所述標簽包括相同化學結構的形式，每種標簽具有可以用高分辨率MS分辨的獨特同位素 物。
[0172] 這種標簽的一個實例是相同肽的不同同位素物。此實例使用天然具有多種同位素 的元素作為標簽，并且其中同位素具有獨特質量虧損。
[0173] 使用質量虧損標簽使報告子肽偏移到質量色譜圖的觀察不到大部分同位素的區 域（有時稱為質量安靜空間）中。此實例適用于增強具有許多其它背景離子的質量區域中 的檢測的靈敏度和特異性。
[0174] 如本領域技術人員已知，細胞培養物中使用氨基酸進行穩定同位素標記（SILAC) 和其變體使用質譜以在樣品中間對蛋白質進行定量和比較，并且使用結構蛋白、伴侶蛋白 或管家酶對生物變異的樣品標準化和測量使得眾多的樣品可被處理和比較。使用串聯質量 標簽（TMT)或用于相對和絕對定量的同量異位素標簽（iTRAQ)的同量異位素標記使用質譜 以定量和比較蛋白質，以用于對來自細胞和組織裂解物、血清和血漿以及福爾馬林固定石 蠟包埋組織切片中的蛋白質的肽進行定量。TMT和iTRAQ具有通式結構M-F-N-R，其中M = 質量報告子區域，F =裂解連接區域，N =質量標準化區域，并且R =蛋白質反應性基團。M 和N中的各個位置處取代的同位素導致每種標簽在M區域中具有不同分子量，在N區域中 具有相應質量變化，以便標簽的集合具有相同總分子量。僅當TMT經歷第二或第三碎片化 (如在串聯質譜MS/MS或三重質譜MS/MS/MS中）時，其是可區別的，主鏈碎片化產生序列， 并且標簽碎片化產生對肽進行定量所需要的質量報告子離子。iTRAQ和TMT共價標記蛋白 質消化物中的胺基，并且半胱氨酸反應性TMT標記半胱氨酸的巰基，產生具有獨特質量標 簽的個別消化物。然后將經標記的消化物匯集并且碎片化為肽主鏈和報告子離子。肽主鏈 離子用以鑒別其所來自的蛋白質。報告子離子用以對組合樣品中的每一者中的此蛋白質進 行定量。
[0175] 本領域技術人員已知用于蛋白質定量的不含標記的SILAC、TMT、iTRAQ和其它質 譜分析方法用于生物標記物發現中以在包括以下的儀器上生成候選標記物：LTQ Velos (賽 默科技（Thermo Scientific))、LTQ Orbitrap Elite (賽默科技）和 Q Exactive (賽默科 技）混合質譜儀。然后進一步評價候選標記物，并且將其使用選擇反應監測（SRM)或選擇離 子監測（S頂）應用于靶向分析測定中以對許多樣品中的肽標記物進行靶向定量。為了確認 和驗證，如下文所解釋，將通用報告子肽U進行定制以用于先前鑒別的標記物，用于用合成 穩定同位素標記的肽標準物（HeavyPeptide AQUAplex和其變異，賽默科技）使用現有發現 數據以對用于革巴向分析的初步選擇進行自動化（Pinpoint軟件（賽默科技）；TSQ Vantage 三級四極質譜儀（賽默科技））而進行絕對定量。將數據輸入到用于臨床應用的一體式數 據管理系統中。
[0176] 一個【具體實施方式】是通用報告子肽Uplex同位素物集合，其經合成以向其提供與 定制肽類似（例如，±10%到20%)的性質（例如，滯留時間、離子化、最優碎片化能量、檢 測極限、消化效率等）。在使用此【具體實施方式】的方法中，通用報告子肽Uplex同位素物集 合用以評估消化效率。在使用中，此【具體實施方式】允許評估蛋白質型肽以及未消化和消化 的定制肽和通用報告子肽Uplex同位素物集合。然后將定制和通用肽到個別肽的消化效率 用以校正定量的蛋白質型肽的水平，允許對目的蛋白質進行更準確絕對定量和通過針對樣 品之間的消化效率校正而在樣品之間進行更準確定量。
[0177] -個【具體實施方式】是通用肽Uplex同位素物集合的集合。通用肽Uplex同位素物 集合的此集合以可預測方式共洗脫。集合中的肽可以或可以不共有公用序列。集合中的肽 在獨特位置處并有穩定同位素物集合以使得能夠對每一者進行特定定量。
[0178] -個【具體實施方式】是通用同位素物肽集合化合物、組合物、配制品和/或試劑盒。 在一個【具體實施方式】中，重同位素物蛋白質型肽集合一報告子肽R可以無水配制。在一個
【具體實施方式】中，重同位素物蛋白質型肽集合一報告子肽R可以在溶液中配制。使重同位 素物蛋白質型肽集合一報告子肽R穩定化，并且通過使用本領域技術人員已知的方法將其 與非還原糖（例如，山梨糖醇、甘露糖醇等）一起配制而促進溶解。在此形式下，其在阿摩 爾（attomole)或飛摩爾（femtomole)量下穩定。在一個【具體實施方式】中，將重同位素物蛋 白質型肽集合一報告子肽R配制為片劑，其可以在環境溫度下運輸和儲存并且在需要用于 液體測量時將容易轉移到小瓶中。此形式消除了關于肽與管壁的結合非特異性或溶劑蒸發 導致肽濃度變化的問題。此【具體實施方式】減少了所需操作的數目，并且因此減小誤差。此
【具體實施方式】促進了自動化。
[0179] 實施例1
[0180] 以預定比例的同位素物的含有通用報告子肽Uplex同位素物集合的穩定同位素 標記的肽，以及若干與報告子肽串接在一起的肽，用以對臨床樣品中的蛋白質生物標記物 進行檢測和定量，其中集中于肺癌的標記物。
[0181] 為了評估樣品制備方法的回收率，在蛋白水解前后，對樣品中的人血漿蛋白（LDH、 NSE和Myo)的重同位素物標記的合成多肽標準物（包含至多三種蛋白質型肽和通用報告子 R)加標。在混合質譜儀儀器（Q Exactive，賽默飛世爾科技（ThermoFisher Scientific)) 上以S頂模式進行HPLC-MS分析。基于先前鑒別的一系列候選物合成串接參考肽的集合。 由賽默飛世爾科技（德國烏爾姆（Ulm Germany))獲得合成多肽。
[0182] 將報告子肽R設計得在C末端處具有胰蛋白酶裂解位點。在肽合成期間，通過使 用預定比例的同位素物氨基酸前體的混合物，確定用于通用報告子Uplex肽的同位素物校 準曲線標準物。在通過采用1:1化學計量的報告子：靶向分析物串接肽進行胰蛋白酶處理 之后，容易測定每種靶向分析物肽與報告子相比的相對響應因子。
[0183] 選擇一組表示肺癌的蛋白質來證實原理證明