通過質譜分析用復用內標物對蛋白質和蛋白質修飾的絕對定量的制作方法
【專利說明】通過質譜分析用復用內標物對蛋白質和蛋白質修飾的絕對 r-^-i 日 疋垔
[0001] 本申請要求2013年6月7日提交的共同未決的美國申請第61/832, 380號的優先 權，其明確地以全文引用的方式并入本文中。
[0002] 質譜（MS)與用穩定重同位素標記的內標肽結合提供了對生物和其它樣品中的 肽、多肽和蛋白質的快速、準確并且精確的絕對定量。
[0003] 本發明MS方法提供了通過高分辨率質譜分析使用復用內標同位素物的靶肽定 量。所述方法使用AQUA肽（W0 03/016861)和/或用NeuCode氨基酸合成的重蛋白質（赫 伯特（Hebert)等人，用于復用蛋白質組定量的中子編碼的質量簽名（Neutron-encoded mass signatures for multiplexed proteome quantification),自然美國公司(Nature America, Inc.) 2013 高級在線出版物（Advance Online Publication))。在一個具體實施 方式中，所述方法用于TMT測定。在一個【具體實施方式】中，所述方法用于通用報告子測定 (W02012/005838 ;W0 2012/006406)。
【發明內容】
[0004] -個【具體實施方式】是一種使用復用重肽內標物的至少一個集合通過質譜（MS)在 樣品中進行絕對蛋白質或肽定量的方法，其中所述集合內的每種肽含有相同氨基酸序列， 但所述集合內的所述肽相差質量虧損，所述質量虧損通過在至少一個氨基酸分子內的不同 原子上并入重同位素而產生。每個集合內的所述重肽內標物在每種肽內含有相同數目的總 中子，但不同在于，所述氨基酸內的重原子分布為每種肽所特有。每個集合內的所述重肽內 標物在低分辨率質譜分析下分辨為單峰，并且在高分辨率質譜分析下分辨為多峰。每個集 合內的所述重肽內標物在每種肽之間含有小于1道爾頓的質量差異。所述樣品可以是生物 樣品，所述方法用于診斷測定。所述方法可以用于通用報告子測定。所述方法可以用于多 樣品分析。所述方法可以用于多靶分析。所述方法可以用于多樣品分析和多靶分析。所述 重肽通過以下方式制備：合成至少兩種肽與重氨基酸的同位素物的混合物，產生具有不同 質量虧損的重肽。同位素物通過以確定比例混合固相固定的AQUA肽前體而制備。所述樣 品通過實施所述靶蛋白質或肽的裂解而制備。靶肽峰的量可以通過使用已知量的至少兩種 同位素物標準肽的標準曲線而獲得。所述方法可以用以驗證所述靶蛋白質或肽不含同量異 位素干擾。
[0005] -個【具體實施方式】是一種通過以下方式通過質譜進行蛋白質或肽定量的方法： (a)制備含有目的靶蛋白質或肽的樣品用于質譜分析，（b)制備多種具有所述靶蛋白質或 肽的至少一種子序列的重同位素標記的肽，（c)將已知濃度下的所述重同位素標記的肽與 所述樣品混合，（d)使含有所述制備的樣品和所述重同位素標記的肽的混合物經歷低分辨 率下的質譜分析，由此獲得單累加重肽質譜分析峰與相應單輕肽質譜分析峰，（e)使所述 低分辨率峰經歷高分辨率質譜分析，由此獲得多個代表所述重同位素異構體肽的質譜分析 峰，（f)生成輕肽強度：重肽強度比，和（g)基于所述重同位素標記的肽的強度對所述多個 質譜分析峰中的每一者的強度進行定量以對所述樣品中的蛋白質或肽的量進行定量。所述 重肽通過以下方式制備：合成至少兩種肽與重氨基酸的同位素物的混合物，產生具有質量 虧損的重肽。同位素物通過以確定比例混合固相固定的AQUA肽前體而制備。所述樣品通 過實施所述靶蛋白質或肽的裂解而制備。靶肽峰的量可以通過使用已知量的至少兩種同位 素物標準肽的標準曲線而獲得。步驟（f)可以使用來自MS分析的標準曲線的結果。步驟 (f)可以進一步包含制備氨基酸的多種同位素物；使用所述同位素物以生成重肽標準物的 集合；以固定比例混合所述多種含同位素物的肽；在低質量分辨率和高質量分辨率下分離 所述混合的含同位素物的肽；使用低質量分辨率以測定輕：重肽比；和使用高質量分辨率 分離結果制備標準曲線。
[0006] -個【具體實施方式】是一種肽同位素物合成的方法，其中將多種前體氨基酸同位素 物，含有α羧酸酯基的氨基酸以確定比例與含有綴合基團的固相肽合成樹脂混合，以通過 所述α羧酸酯基固定化所述同位素物。在使所述前體氨基酸同位素物綴合之后，所述肽合 成樹脂混合物包含多種以已知比例綴合到所述樹脂的固定化的氨基酸同位素物。包含以已 知比例固定化的所述氨基酸同位素物的所述樹脂可以進一步用于肽合成，以產生含有多種 同位素物的重肽集合。
[0007] -個【具體實施方式】是一種肽同位素物合成的方法，包含將多種前體氨基酸同位素 物與含有至少一個已經合成到具有所要序列的前體肽中的氨基酸的固相肽合成樹脂混合， 其中所述前體氨基酸同位素物使用標準氨基酸合成程序而變得連接到所述肽的N末端。使 所述前體氨基酸同位素物綴合到所述固定化肽產生含有已知比例的同位素物混合物的重 肽的集合。包含以已知比例固定化的所述氨基酸同位素物的所述樹脂可以進一步用于肽合 成，以產生含有多種同位素物的重肽集合。
[0008] -個【具體實施方式】是一種蛋白質同位素物合成的方法，包含在體外或基于細胞的 蛋白質表達系統中使用多種前體氨基酸同位素物以合成具有所要序列的目的蛋白質，其中 所述前體氨基酸同位素物變得并入到所述目的蛋白質中。在所述表達的蛋白質中并入所述 前體氨基酸同位素物產生含有多種同位素物的重蛋白質集合。
[0009] -個【具體實施方式】是一種通過高分辨率質譜使用復用內標肽同位素物進行靶向 肽定量的方法。
[0010] -個【具體實施方式】是一種通過以下方式生成質譜分析的標準曲線的方法：制備氨 基酸的多種同位素物以生成重肽標準物，以固定比例混合所述多種同位素物，以低分辨率 定量或高分辨率定量分離所述混合的同位素物，和使用分離結果以制備標準曲線。
[0011] -個【具體實施方式】是一種通過高分辨率質譜使用一種或多種肽進行靶向肽定量 的方法，所述一種或多種肽通過蛋白水解消化而來源于復用內標蛋白質同位素物。
[0012] -個【具體實施方式】是一種通過以下方式生成質譜分析的標準曲線的方法：制備氨 基酸的多種同位素物以生成重蛋白質標準物，以固定比例混合所述多種同位素物，用蛋白 酶消化同位素物集合，以低分辨率定量或高分辨率定量分離所述混合的同位素物，和使用 分離結果以制備標準曲線，所有肽通過蛋白水解消化而來源于所述蛋白質同位素物集合。
[0013] -個【具體實施方式】是一種通過以下方式生成質譜分析的標準曲線的方法：制備氨 基酸的多種同位素物以生成重蛋白質標準物，以固定比例混合所述多種同位素物，用蛋白 酶消化同位素物集合，和添加一種或多種已知量的獨特同位素的獨特內標肽，以低分辨率 定量或高分辨率定量分離所述混合的同位素物，和使用分離結果以制備標準曲線，所有肽 通過蛋白水解消化而來源于所述蛋白質同位素物集合，并且用于對相同序列的相應肽進行 絕對定量的所述獨特同位素肽通過消化天然蛋白質和重同位素物蛋白質集合而得到。
[0014] -個【具體實施方式】是一種通過以下方式合成單同位素物集合的方法：以確定所要 比例預混合固相固定前體氨基酸。
[0015] -個【具體實施方式】是一種通過以下方式進行的質譜分析分析物定量方法：(a)由 含有具有已知氨基酸序列的肽分析物的樣品制備多種包含所述分析物序列的至少部分的 重同位素物標記的標準物；(b)添加已知量的步驟（a)的產物到所述樣品中；(c)使所述樣 品中的蛋白質裂解以產生肽；（d)對所述樣品中的所述多種重同位素物標記的標準物進行 定量；和（e)基于（d)的所述定量，測定所述樣品中的分析物的量。所述樣品中的所述多種 重同位素物標記的標準物的定量通過高分辨率質譜分析行。步驟（a)的每種標準物通過并 入不同元素的重原子但具有相同總數目的中子而不同于其它標準物。將不同重原子并入到 所述標準物中在所述標準物之間產生質量虧損。所述多種重同位素物標記的標準物的峰值 強度在高分辨率MS下含有多個可分辨峰，所述多個可分辨峰中的每一者代表所述多種重 同位素標記的標準物的不同地標記的標準物。所述方法使用所述多個可分辨峰作為一系列 已知濃度的所述多種重同位素物標記的標準物而生成標準曲線。
[0016] -個【具體實施方式】是多種具有相同氨基酸序列的重同位素標記的肽標準物，所述 肽標準物各自包含重氨基酸的不同同位素物，并且各自具有相同標稱質量和化學式但具有 13C-、15N-、ls0-、34S-或2H-的不同置換，以產生具有毫道爾頓質量虧損的肽標準物。所述重 同位素標記的肽標準物用于質譜分析中。
[0017] -個【具體實施方式】是多種具有相同氨基酸序列的重同位素標記的蛋白質標準物， 所述蛋白質標準物各自包含重氨基酸的不同同位素物，并且各自具有相同標稱質量和化學 式但具有 13〇、1%-、180-、345-或％-的不同置換，以產生具有毫道爾頓質量虧損的肽標準物。 所述重同位素標記的蛋白質標準物用于質譜分析中以對給定靶蛋白質的每種肽進行定量。
[0018] 一個【具體實施方式】是一種對樣品中的蛋白質、多肽或肽進行定量的試劑盒。所述 試劑盒包含多種具有相同氨基酸序列的重同位素標記的蛋白質和/或肽標準物，所述蛋白 質和/或肽標準物各自包含重氨基酸的不同同位素物，并且各自具有相同標稱質量和化學 式但具有 13C-、15N-、ls0-、34S-或2H-的不同置換，以產生具有毫道爾頓質量虧損的肽標準物； 和使用所述試劑盒通過質譜對所述樣品中的所述蛋白質、多肽或肽進行定量的說明書。所 述試劑盒可以具有在復用測定中使用所述標準物的說明書。所述試劑盒可以具有在診斷測 定中使用所述標準物的說明書。
[0019] -個【具體實施方式】是一種使用復用重肽內標物通過質譜在樣品中進行絕對蛋白 質或肽定量的方法，所述重肽內標物使用受保護的氨基酸同位素物作為重同位素物前體用 于肽合成而制備。所述受保護的氨基酸同位素物可以包含芴基甲氧羰基（FMOC)保護的重 同位素物前體用于肽合成。所述方法可以進一步包括以所要比例混合重同位素物肽的集合 以用作復用內標物。將所述FMOC保護的氨基酸前體以確定比例混合，并且隨后在單一反應 中合成肽同位素物混合物。芴基甲氧羰基（FMOC)保護的同位素物的混合物可以按確定比 例用于肽合成中。
[0020] -個【具體實施方式】是一種使用復用重蛋白質內標物通過質譜在樣品中進行絕對 蛋白質或肽定量的方法，所述重蛋白質內標物使用氨基酸同位素物作為重同位素物前體用 于蛋白質合成而制備。所述方法可以進一步包括以所要比例混合重同位素物蛋白質的集合 以用作復用內標物。將所述氨基酸前體以確定比例混合，并且隨后在單一反應中合成蛋白 質同位素物混合物。氨基酸同位素物的混合物可以按確定比例用于蛋白質合成中。
[0021] -個【具體實施方式】是一種使用標準曲線使用質譜分析對樣品中的靶蛋白質或肽 進行絕對定量的方法，所述標準曲線在所述MS分析中對所述靶蛋白質或肽是特定的。所述 方法首先以低分辨率并且隨后以高分辨率分辨復用內標蛋白質和/或肽同位素物。其可以 用于通用報告子測定。所述蛋白質或肽可以用于在全動態范圍內診斷患者的醫療或生理狀 況。
[0022] -個【具體實施方式】是一種使用質譜分析和用標準曲線對樣品中的靶蛋白質或肽 進行絕對定量的方法，所述標準曲線在所述MS分析中對所述靶蛋白質或肽是特定的，所述 標準曲線由肽混合物生成，所述肽混合物用重氨基酸的不同同位素物合成，在所述蛋白質 或肽中產生至少ImDa的質量虧損。所述方法可以進一步包含獲得單低分辨率MS峰，然后 獲得多個高分辨率峰，和對每種同位素物的強度進行定量以使用所述標準曲線對所述樣品 中的所述靶蛋白質或肽進行定量。
[0023] -個【具體實施方式】是一種使用質譜分析和用標準曲線對樣品中的靶蛋白質或肽 進行絕對定量的方法，所述標準曲線在所述MS分析中對所述靶蛋白質或肽是特定的，所述 標準曲線由蛋白質混合物生成，所述蛋白質混合物用重氨基酸的不同同位素物合成，產生 至少ImDa的質量虧損，由蛋白水解消化產生所述蛋白質集合的肽。所述方法可以進一步包 含獲得單低分辨率MS峰，然后獲得多個高分辨率峰，和對每種同位素物的強度進行定量以 使用所述標準曲線對所述樣品中的所述靶蛋白質或肽進行定量。
[0024] -個【具體實施方式】是一種通過質譜分析相對于AQUA蛋白質或肽定量的增強準確 度和/或靈敏度的方法，其使用多于一種肽同位素物，以生成含有用于每個測定的每種標 準物的多個濃度的內標曲線。所述方法可以進一步包含制備重靶肽的至少三個同位素物集 合，通過MS將重靶肽與輕靶肽分離，在低分辨率下比較所述重靶肽與輕靶肽的峰以測定所 述靶肽的濃度，和在高分辨率下分辨同位素物和基于所述內標曲線分析代表不同同位素物 濃度的每個峰。
[0025] -個【具體實施方式】是一種通過質譜分析相對于AQUA蛋白質或肽定量的增強準確 度和/或靈敏度的方法，其使用多于一種蛋白質同位素物，以生成含有每種標準物的多個 濃度的內標曲線，所述每種標準物針對天然蛋白質分析物的每種相應肽。所述方法可以進 一步包含制備重靶蛋白質的至少兩個同位素物集合，通過MS將重靶肽與輕靶肽分離，在低 分辨率下比較所述重靶肽與輕靶肽的峰以測定所述靶肽的濃度，和在高分辨率下分辨同位 素物和基于所述內標曲線分析代表不同同位素物濃度的每個峰。
[0026] -個【具體實施方式】是一種基于質量虧損而生成質譜分析的標準曲線的方法。所述 方法包含制備氨基酸的多種同位素物以生成重肽標準物，以固定的所要比例混合所述多種 同位素物，用低分辨率MS或用高分辨率MS分離所述混合的同位素物，然后使用分離結果以 制備標準曲線。分離可以通過LC-MS進行，并且所述標準曲線可以用完整離子制備。分離 可以通過LC-MSn進行，并且所述標準曲線可以用碎片離子制備。所述方法可以用以驗證所 述靶蛋白質或肽不含同量異位素干擾。
[0027] -個【具體實施方式】是一種基于質量虧損而生成質譜分析的標準曲線的方法。所述 方法包含制備氨基酸的多種同位素物以生成重肽標準物，以固定的所要比例混合所述多種 同位素物，用低分辨率MS或用高分辨率MS分離所述混合的同位素物，然后使用分離結果驗 證MS校準。
[0028] -個【具體實施方式】是一種基于質量虧損而生成質譜分析的標準曲線的方法。所述 方法包含制備氨基酸的多種同位素物以生成重肽標準物，以固定的所要比例混合所述多種 同位素物，用低分辨率MS或用高分辨率MS分離所述混合的同位素物，然后使用分離結果驗 證目標分析物的質量偏移。
[0029] -個【具體實施方式】是一種質譜分析定量方法，包含（a)制備多種蛋白質同位素 物，（b)制備重肽內標物，（c)將（a)和（b)加標（spiking)到目標樣品中，（d)消化所述目 標樣品（c)，（e)對由天然靶蛋白質分析物（c)和重蛋白質同位素物（a)消化得到的每種相 應輕：重肽進行定量，（f)通過MS分析分離所述肽，和（g)用所述重肽內標物（b)對所述 輕和重肽同位素物進行定量，以使用所述內標物和來自目標和內標蛋白質集合的所有相應 輕：重同位素物肽對來對所述目標分析物肽進行定量。
[0030] -個【具體實施方式】是一種質譜分析定量方法，包含（a)制備多種質量標簽同位素 物，（b)制備用所述質量標簽同位素物標記的肽內標物，（c)將（a)和（b)加標到目標樣品 中，（d)消化所述目標樣品（c)，（e)用所述標簽的輕版本標記所述目標樣品和所得通用報 告子肽，（f)通過MS分析分離所述肽，和（g)使用所述內標物對目標分析物進行定量。
【附圖說明】
[0031] 圖1展示使用內標物對蛋白質目標的質譜分析（MS)定量。
[0032] 圖2展示兩種同位素異構體（isotopomer，具有不同重同位素原子的化學異構體， 以便所述異構體具有相同單位質量但同位素元素不同）的低分辨率MS和高分辨率MS。
[0033] 圖3展示不同濃度的三種不同同位素異構體在高MS分辨率下的標準曲線的生成。
[0034] 圖4示意性地說明使用溶液中的或固定化在固體支持物上的前體氨基酸同位素 物（isotopologue)的確定混合物而合成內標物。
[0035] 圖5展示賴氨酸+SDa同位素物與兩種市售同位素物（填充黑色，來自赫伯特等人 2013)的可能重同位素組合和質量。
[0036] 圖6展示賴氨酸+8Da同位素物與七種6毫道爾頓（mDa)間隔的代表性同位素物 (加框）的39種可能化學式和質量。
[0037] 圖7a_b展示精氨酸+6Da同位素物與七種6mDa間隔的代表性同位素物（加框，圖 7a)的37種可能化學式和質量，和精氨酸+IODa同位素物與七種6mDa間隔的代表性同位素 物（加框，圖7b)的86種可能化學式和質量。
[0038] 圖8展示九種代表性芴基甲氧羰基（FMOC)保護的氨基酸的化學結構，所述氨基酸 可以通過在加框區域中同位素標記而用作重同位素物前體用于肽合成。
[0039] 圖9展示三嗪和嘌呤核心分子和相應胺反應性N-羥基琥珀酰亞胺衍生物的化學 結構。
[0040] 圖10a-b展示三嗪核心（圖10a)的13種可能同位素物和嘌呤核心（圖10b)與 六種6mDa間隔的代表性同位素物（加框）的15種可能同位素物。
[0041] 圖11示意性地展示用于質譜定量的肽。
[0042] 圖12示意性地展示待定量的肽鍵聯到報告子肽并且關聯到通用肽U的配置，所述 肽各自用一種或多種重氨基酸或重氨基酸同位素物標記。
[0043] 圖13示意性地展示多于一種肽的定量的【具體實施方式】，每種肽鍵聯到單獨報告 子肽R，其中每種肽和報告子肽用重氨基酸或重氨基酸同位素物標記。
[0044] 圖14示意性地展示三個串接重肽同位素物集合鍵聯到單報告子肽R的具體實施 方式。
[0045] 圖15示意性地展示使用單一測定（復用）同時測定樣品中的多于一種分析物的
【具體實施方式】，其中三個蛋白質型肽同位素物集合各自可裂解地鍵聯到其自身的報告子肽 R并且關聯到單通用報告子肽Uplex同位素物集合。
[0046] 圖16示意性地展示組分中間的配置和關系。
[0047] 圖17示意性地展示肽組分中間的配置和關系。
[0048] 圖18示意性地展示SEQ ID NO. 22-25的命名規則。
[0049] 圖19示意性地展示靶向定量的天然分析物、鍵聯到報告子肽并且關聯到通用肽U 的對應于靶向分析物的內標（IS)肽的配置。將串接IS:報告子肽和通用肽各自用化學MS 標簽的重同位素物集合標記，并且將加標有內標物的消化的樣品用相同化學MS標簽的輕 或特有同位素物版本標記。
[0050] 圖20展示LVALVR(SEQ ID NO. 22)+IODa同位素物（圖7b中加框）的模擬光譜， 與同位素物峰的放大展開圖（插圖）。
[0051] 圖21a_c示意性地展示使用重氨基酸同位素物與體外蛋白質翻譯試劑盒（圖21a) 或與表達目的蛋白質并且生長于補充有重氨基酸同位素物的標準培養基中的培養細胞 (圖21b)的混合物合成重蛋白質、接著提純用作內標物的重蛋白質同位素物用于相對定量 (圖21c)的方法。
[0052] 圖22展示使用消化的重同位素物標記的蛋白質內標物對混合物中的天然蛋白質 目標的所有相應肽進行相對定量的配置。至少一種肽的獨特重AQUA版本可以用于對重同 位素物標準物和靶蛋白質進行絕對定量。
[0053] 圖23展示使用重蛋白質同位素物集合（1:4比例的13C6 15N2賴氨酸：2H8-賴氨酸用 于體外Aktl合成，#)對細胞裂解物中來自Aktl的天然肽SLLSGLLK(SEQ ID NO. 64)定量的 LC-MS 結果，其中有 IOOfmol 的雙重 AQUA肽 13C615N-亮氨酸，13C6 15N2-賴氨酸，SLL*SGLLK* (SEQ ID NO. 64)加標到混合物中用于絕對定量。
[0054] 本發明的【具體實施方式】如下。
[0055] -種通過以下方式通過質譜（MS)對樣品中的靶蛋白質或肽進行絕對定量的方 法：使用復用重肽內標物的至少一個集合制備內標同位素物，其中所述至少一個集合內的 每種肽含有相同氨基酸序列，但所述集合內的所述肽相差質量虧損而產生內標同位素物， 所述質量虧損通過在至少一個氨基酸分子內的不同原子上并入重同位素而產生；和使用所 述復用內標同位素物對至少一種靶蛋白質或肽進行定量。在一個【具體實施方式】中，每個集 合內的所述重肽內標物在每種肽內含有相同數目的總中子，但不同在于，所述氨基酸內的 重原子分布為每種肽所特有。在一個【具體實施方式】中，每個集合內的所述重肽內標物在低 分辨率質譜分析下分辨為單峰，并且在高分辨率質譜分析下分辨為多峰。在一個具體實施 方式中，每個集合內的所述重肽內標物在每種肽之間含有小于1道爾