一種檢測腫瘤標記物ca72-4的熒光免疫試紙條及制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種血液樣本的快速定量檢測試紙條及檢測方法，尤其是涉及利用量子點技術測定血清或血漿中糖類抗原72-4 (簡稱CA72-4)的快速定量檢測試紙條及其測試方法，屬于腫瘤標志物檢測領域。
【背景技術】
[0002]胃癌是源自胃黏膜上皮的惡性腫瘤，占全部惡性腫瘤的第3位，占消化道惡性腫瘤的首位，且胃癌病人得到確診后其5年生存率非常低。
[0003]CA72-4是1981年Coleher等從乳腺癌肝轉移灶中得到的一種腫瘤相關糖蛋白，其分子量大于1000，000，屬于粘蛋白類癌胚胎抗原。組織化學研究證明它存在于50%的乳腺癌和85% -95%結腸、胰腺、胃、肺及卵巢的腫瘤中，不表現于良性腫瘤和正常成人組織中。一般認為，CA72-4是一種較廣譜的腫瘤標志物，其血清中的含量對卵巢癌、胃癌、直腸癌、肝癌、肺癌等有臨床診斷價值。目前，CA72-4廣泛應用于癌癥的診斷及免疫療法的監測，術前CA72-4的水平亦可作為胃癌侵襲性及病人預后的評估指標。
[0004]目前臨床上用于測定CA72-4的方法主要有放免法、酶聯免疫檢測(簡稱ELISA)法、化學發光法等。放免法檢測因其方法學本身的限制，其靈敏度和抗干擾能力嚴重不足，已基本上退出市場。酶聯免疫檢測技術和化學發光技術是目前臨床檢測CA72-4的主要技術，但是檢測成本高，檢測時間較長。
【發明內容】
[0005]為了解決臨床上測定CA72-4遇到的以上問題，本發明提供一種檢測腫瘤標記物CA72-4的熒光免疫試紙條，采用標記了抗CA72-4單克隆抗體CC49的量子點標記結合墊與包被了抗CA72-4單克隆抗體B72.3的硝酸纖維素膜的檢測線和羊抗鼠IgG的硝酸纖維素膜的質控線進行組合；采用雙抗體夾心免疫層析的原理，樣本中的抗原在側向移動的過程中與量子點標記的特異性抗體相結合，形成抗原-抗體復合物，繼續向前方流動和硝酸纖維素膜的檢測線上特異性抗體結合形成雙抗體夾心復合物，進而進行結果的判定。具備操作簡便，迅速，反應靈敏度高以及便于大規模推廣使用的優點。
[0006]為了實現上述目的，本發明公開了一種檢測腫瘤標記物CA72-4的熒光免疫試紙條，包括樣品墊、量子點標記結合墊、硝酸纖維素膜、吸水紙和底板，其特征在于，所述熒光免疫試紙條所用的免疫層析法的類型為雙抗夾心法，所述樣品墊、量子點標記結合墊、硝酸纖維素膜、吸水紙依次相互重疊地鋪設在所述底板上；所述量子點標記結合墊上設置有量子點標記的抗CA72-4單克隆抗體CC49涂層；所述硝酸纖維素膜上設置有檢測線和質控線，所述檢測線上設置有抗CA72-4單克隆抗體B72.3，所述質控線上設置有羊抗鼠IgG。
[0007]進一步地，所述樣品墊和所述量子點標記結合墊均是玻璃纖維素膜，所述硝酸纖維素膜是pall vividl70，所述底板是聚氯乙烯(簡稱PVC)底板。
[0008]本發明還公開了如上所述的檢測腫瘤標記物CA72-4的熒光免疫試紙條的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:
[0009]步驟一，量子點標記抗體的制備:
[0010]I)將量子點與2嗎啉代乙磺酸(簡稱MES)混合振蕩，離心，棄上清，得到預處理后的量子點；
[0011]2)將所述預處理后的量子點與(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(簡稱m)C)、MES混合，于旋轉混合器上避光反應，然后離心，棄上清，得到沉淀一；
[0012]3)將所述沉淀一與N-羥基硫代琥珀酰亞胺(簡稱NHS)和磷酸鹽緩沖液(簡稱PBS)混合，于旋轉混合器上避光反應，然后離心，棄上清，得到沉淀二 ；
[0013]4)將所述沉淀二與抗CA72-4單克隆抗體CC49、PBS混合，避光反應后，過夜，離心，棄上清，得到沉淀三；
[0014]5)將所述沉淀三用含有牛血清白蛋白(簡稱BSA)的PBS溶液重懸，靜置封閉后，得到量子點標記抗體；
[0015]步驟二，量子點標記結合墊和樣品墊的處理:將玻璃纖維素膜依次用水、無水乙醇浸泡，然后干燥，再置于含有蔗糖、海藻糖和BST的結合墊處理液中浸泡，再干燥，得到經過處理的量子點標記結合墊；將玻璃纖維素膜依次用水、無水乙醇浸泡，然后干燥，再置于含有NaCl、聚乙烯吡咯烷酮(簡稱？￥?)、1^的11-20、854、硼酸鹽緩沖液(簡稱BS)的樣品墊處理液中浸泡，再干燥，得到經過處理的樣品墊；
[0016]步驟三，將所述步驟一得到的量子點標記抗體包被到所述步驟二得到的經過處理的量子點標記結合墊上，得到帶有抗體的量子點標記結合墊；
[0017]步驟四，將抗CA72-4單克隆抗體B72.3固定到檢測線，將羊抗鼠IgG固定到質控線，得到帶有抗體的硝酸纖維素膜；
[0018]步驟五，將所述步驟二得到的經過處理的樣品墊、所述步驟三得到的帶有抗體的量子點標記結合墊、所述步驟四得到的帶有抗體的硝酸纖維素膜、吸水紙依次相互重疊地鋪設在底板上，然后切割以設定試紙條寬度，得到所述檢測腫瘤標記物CA72-4的熒光免疫試紙條。
[0019]進一步地，所述步驟一中加入的量子點、EDC、NHS和CC49按照摩爾比為1:4000:2000:8。
[0020]進一步地，所述步驟一中的含有BSA的PBS溶液為含質量百分比1.5%的BSA的pH值是7.4的PBS溶液，于振蕩器振蕩，封閉30min。
[0021]進一步地，所述步驟二中的結合墊處理液是含質量百分比5%蔗糖、質量百分比2%海藻糖，pH值是7.4的0.02M的硼酸鹽吐溫溶液(簡稱BST)，且量子點標記結合墊的處理具體過程為:將玻璃纖維素膜于超純水浸泡15分鐘后，再置于無水乙醇浸泡15分鐘后，于干燥箱50°C條件下干燥，再置于所述結合墊處理液中浸泡30分鐘后，于干燥箱37°C條件下干燥過夜，得到經過處理的量子點標記結合墊。
[0022]進一步地，所述步驟二中的樣品墊處理液是含質量百分比2% NaCl、質量百分比0.2% PVP、質量百分比0.1% Tween-20、質量百分比0.5% BSA，pH值是7.4的0.02M的BS，且樣品墊的處理具體過程為:將玻璃纖維素膜于超純水浸泡15分鐘后，再置于無水乙醇浸泡15分鐘后，于干燥箱50°C條件下干燥，再置于所述樣品墊處理液中浸泡30分鐘后，于干燥箱37°C條件下干燥過夜，得到經過處理的樣品墊。
[0023]更具體地，所述步驟一的具體過程是:量子點標記抗體的制備:
[0024]I)將pH值是6.0的0.0lM MES加入至100 μ I發射波長為620nm的量子點后，將上述混合物于振蕩器振蕩5秒后，于離心機中14000 - 20000rpm離心5分鐘，棄上清，得到預處理后的量子點；
[0025]2)將所述預處理后的量子點與EDC以摩爾比1:4000混合后，加入pH值是6.0的0.0lM MES中，于旋轉混合器上避光反應15min，然后14000 — 20000rmp離心2min，棄上清，
得到沉淀一；
[0026]3)將所述沉淀一與NHS以摩爾比1:2000混合后，加入100 μ I 0.02Μ pH值是7.2的PBS緩沖液中，于旋轉混合器上避光反應15min，然后14000 — 20000rmp離心2min，棄上清，得到沉淀二；
[0027]4)將所述沉淀二與抗CA72-4單克隆抗體CC49以摩爾比1:8混合后，加入100 μ I0.02Μ pH值是7.2的PBS緩沖液中，室溫避光反應3小時，而后置于17°C 16?20小時，14000rpm離心2min，棄上清，得到沉淀三；
[0028]5)將所述沉淀三用100 μ I含有質量百分比1.5%的BSA pH值是7.4的PBS緩沖液重懸，靜置封閉30min后，得到量子點標記抗體。
[0029]本發明還提供如上所述的檢測腫瘤標記物CA72-4的熒光免疫試紙條的應用方法，其特征在于:
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