r>【具體實施方式】
[0045] 下面結合附圖對本發明的技術方案做進一步說明：
[0046] 實施例1
[0047] 本申請發明人在開發本發明技術方案的過程中對小球藻C.zofingiensis胞內郵 青素含量的變化趨勢進行了研究。
[0048] 1. 1商種活化及種子液制各
[0049] 將實驗室中保存的小球藻化lorellazofingiensis菌種轉接到裝有改良Basal 培養基的斜面上進行培養，培養溫度為28°C，光照為10ymolnr2s4,并觀察小球藻生長情 況。
[0化日]用接種環將小球藻藻苔接種到裝有改良Basal液體培養基，在溫度為28°C、光照 為10ymolnT2s^i條件下培養3~5天用作種子液。
[CK)5U 其中所述的改良Basal培養基（P冊.1)成分如下表1所示（單位為mg/L);
[00巧表1[0053]
[0055] 1. 2小球藻C.zofinRiensis在高光、f氏氮條件下培養矛只累蟲下青素
[0化6] 1. 2. 1小球藻C.zofingiensis的高光、低氮培養條件
[0057] 將種子液按10%接種量接種到改良Basal培養基中進行小球藻C.zofingiensis 培養積累郵青素。發酵培養基采用改良Basal培養基，其和表1中的培養基的不同在于：其 葡萄糖為30g/L，另外添加了NaN〇3為0. 6g/l，抑為6. 5。
[0化引培養條件為；溫度為28°C、光照強度為80ymolnr2s-iW上，培養12天。培養過程 中取樣測定小球藻細胞生物量（結果見圖1);對培養14化、16她、19化、216K24化、26化、 28她的小球藻培養液取樣備用；對所取樣中的部分小球藻培養液離屯、收集細胞，離屯、洗漆 后凍干，置于-20°C冰箱中進行冷凍保存，保存的凍干藻粉樣品包括培養14化、16她、19化、 216K24化、26化、28她的凍干藻粉，用于后續小球藻胞內色素含量的分析。
[0化9] 1. 2. 2小球藻胞內郵青素的HPLC檢測方法
[0060] 1. 2. 2. 1小球藻胞內郵青素的提取方法
[006U 準確稱取凍干藻粉lOmg，置于裝有陶瓷珠的凍存管中，加入含有0. 1% (質量）BHT 的二氯甲燒和甲醇的混合溶劑中，該混合溶劑中二氯甲燒；甲醇的體積比為3:1，高速振蕩 1分鐘，然后置于液氮中迅速冷卻，離屯、收集上清液；沉淀再次加入含有0. 1 % (質量）BHT 的二氯甲燒和甲醇的混合溶劑中，振蕩，置于液氮中冷卻，離屯、收集上清液，重復該步驟直 至藻細胞呈無色為止。合并所有上清液，用氮氣吹干后，用色譜純的甲醇和MT邸的混合溶 劑（二者的體積比為1:1)溶劑定容到山以用于后續HPLC分析測定小球藻胞內色素含量。
[0062] 1. 2. 2. 2郵青素的HPLC測定方法
[0063] 小球藻C.zofingiensis胞內郵青素的HPLC檢測方法；采用配備PDA檢測器和 YMC?C30色譜柱（4.6mmX150mm，3ym)的液相色譜儀進行分析，洗脫液為色譜級甲醇 (流動相A)、甲基叔了基離MTBE(流動相B)和水（流動相C)。梯度洗脫程序為；0-6min， 95 一 80%A、5 一 20%B、0%C;6-12min, 80 一 60%A、20 一 38%B、0 一 2%C;12-28min， 60 一 50%A、38 一 48%B、2%C;28-33min，50%A、48%B、2%C;33-35min，50 一 95%A、 48 一 5%B、2 一 0%C;35-38min，95%A、5%B、0%Co
[0064]柱溫箱溫度為30°C，洗脫液流速為0.8血/min,進樣量為20 yL，PDA檢測器檢測波 長在300-700nm進行全波長掃描W測定色素吸收光譜圖，同時在480nm波長下測定郵青素 含量。郵青素的定性分析采用保留時間和吸收光譜圖進行分析，定量分析采用標準品制作 的標準曲線進行分析。
[00化]郵青素標準曲線的制作；準確稱取郵青素標準品，采用色譜純的甲醇和MTBE的混 合溶液（二者體積比為1:1)進行定容，配制成濃度分別為1、2、3、4、5、6^3/1111^郵青素系列 標準溶液，采用上述HPLC法進行測定，W液相峰面積為縱坐標，W標準品濃度為橫坐標，進 行線性回歸分析，從而獲得郵青素的定量標準曲線；Y= 1786.細-0. 2668 (R2= 0. 9975)， 其中X表示郵青素濃度（yg/mL)，Y表示液相峰面積。
[0066] 1. 2. 3小球藻生物量和胞內郵青素含量的變化規律
[0067] 通過1. 2. 2中的HPLC測得方法測定1. 2. 1的小球藻培養14化、16她、19化、216K 24化、26化、28她的小球藻樣品的郵青素含量，并將其換算為相對每g干藻粉的郵青素含 量，結果可參見圖1。由圖1可知，小球藻生物量最高達到3. 37g/l，胞內郵青素在培養到第 6天后開始逐漸增長，含量最高達到2. 3mg/g干燥粉。
[0068] 實施例2小球藻胞內郵青素含量與小球藻細胞的平均巧光強度的相關性
[0069] 本申請發明人在實施例1中小球藻C.zofingiensis的培養過程中，發現小球藻細 胞由綠色變成澄紅色，該主要是由于細胞內的葉綠素和初級類胡蘿h素在高光、低氮等脅 迫條件下，可W誘導積累成次級類胡蘿h素，主要是郵青素等類胡蘿h素。光學顯微鏡下的 小球藻細胞在培養起始、培養過程中、及結束時的細胞形態分別如圖2中A、B、C圖所示。
[0070] 郵青素在特定波長激發后，可W分別呈現最大的發射波長，該與其在細胞內的含 量是相關的。本實施例采用BDAccuriC6流式細胞儀測定小球藻細胞在化l(533/30nm) 通道和化2 (585/40nm)通道中所有細胞的平均巧光強度，從而研究其與小球藻胞內郵青素 積累量之間的關系。
[007。 2. 1流式細胸化的檢測參撒:
[0072] 在流式細胞儀的流速控制（Fluidics)設置方面，為了實現最好的檢測效果，需要 對進樣流速進行控制優化，進樣流速可W設定為14-100yL/min之間。在設定進樣流速時， 需要保證檢測的細胞速率為2500個/秒（events/sec)及W下，否則會影響測定值的準確 性。在樣品測定過程，為保證實驗的準確性，可設定固定的流速為35uL/min。在檢測闊 值訂虹eshold)設置方面，則設定前向角散射光的峰高參數（FSC-H)為80000。在色彩補 償（SetColorCompensation)的設定方面，可W設置補償值均為0%。在進樣控制（Run Settings)設置方面，可分別選擇細胞數巧vents)、進樣時間（Time)、進樣體積（Volumn)進 行設定，保證最終檢測的目標細胞數在10000個W上。
[0073] 2. 2流式細胸化檢測所用待測樣品的前化理方法
[0074] 待測樣品在分析前，采用3800Xg離屯、力的轉速分離收集小球藻培養液或懸浮液 中的藻細胞，再采用去離子水或者磯酸鹽緩沖濃度（lOmM，pH7.4)懸浮，重復兩次后重新 懸浮。制成的重懸液要保證小球藻細胞密度為6X105~2X106C即/血（個/血）之間，一 方面要滿足流式細胞儀的進樣要求（每mL中細胞數或顆粒數為1X1〇3~5X10 6)，另一方 面過高或過低的細胞密度都會影響巧光值的準確測定。最后采用40ym的水相濾膜過濾待 測細胞懸液后，置于2mL離屯、管中用于樣品測定，進樣前要搖勻，保證樣品檢測結果的準確 性。
[00巧]2. 3樣品檢郷抑分析
[0076] BDAccuriC6流式細胞儀檢測樣品中細胞平均巧光強度時，分別檢測 FLU533nm)、FL2巧85nm)通道下的樣品中細胞的平均巧光強度。小球藻胞內的郵青素在流 式細胞儀配備488nm氣離子激光器的激發下可W發射不同波長的巧光，但巧光強度可能差 異很大。通過劃口選定所有的小球藻細胞，然后創建巧光通道FL1和FL2的直方圖，流式細 胞儀自動計算出小球藻細胞在FL1通道和FL2通道的平均巧光強度。
[0077]將實施例1中培養14化、16她、19化、216K24化、26化、28她的小球藻培養液按上 述2. 1~2. 3的步驟和方法制備樣品，并檢測各樣品在FL1和FL2通道的平均巧光強度。檢 測結果見圖7,從圖7可見，小球藻培養過程中從第6天起，開始在胞內逐漸積累郵青素，其 細胞的平均巧光強度也在不斷增加。實施例1中培養14化、16她、19化、216K24化、26化、 28她的小球藻樣品采用實施例1的HPLC法測定的小球藻胞內郵青素的組分如圖8所示，其 中郵青素的種類主要包括有游離郵青素、郵青素一醋和郵青素二醋。結合圖1、2分析可知， 小球藻胞內郵青素含量與小球藻細胞的平均巧光強度都在同步增加，兩者之間存在一定的 相關性。
[007引實施例3小球藻細胞平均巧光強度與HPLC法測得的郵青素含量的線性回歸分析
[0079] 為了實現對于小球藻胞內郵青素含量的快速準確分析，本實驗通過流式細胞儀測 定細胞平均巧光強度，并與小球藻胞內的郵青素含量進行線性回歸分析，從而確定了流式 細胞術快速準確無損檢測方法。
[0080] 在實施例1中，通過HPLC測定法測得了培養至第14化、16她、19化、216K24化、 26化、28她的小球藻樣品其小球藻胞內郵青素含量，結果如圖1所示。將該些郵青素含量 測得值（單位按yg/g計，表示每克干藻粉中郵青素的含量）的W10為底的常用對數值 作為縱坐標，同時分別與實施例2中測得的相應的在流式細胞術FL1和FL2通道的平均巧 光強度值的W10為底的常用對數值作為橫坐標，進行作圖，并進行線性回歸分析，結果如 圖9、10所示。如圖9所示，針對FL1通道的平均巧光強度值，獲得的線性回歸曲線為Y= 1. 93細-5. 6681 (R2= 0. 8725)，式中Y表示小球藻胞內郵青素含量（yg/g干燥粉）的常用 對數值（W10