一種快速無損檢測小球藻胞內蝦青素的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微藻胞內色素的快速無損檢測技術，特別設及一種基于巧光檢測技術 的小球藻胞內郵青素的快速無損檢測方法。
【背景技術】
[0002] 郵青素（astaxanthin)被稱為"超級抗氧化劑"，抗氧化能力是其它類胡蘿h素如 0 -胡蘿h素、玉米黃素、葉黃素和角黃素等的10倍多，具有清除自由基、阻止脂質過氧化 能力，在預防動脈硬化、帕金森綜合癥、視網膜黃斑變性等年齡相關性疾病方面具有重要作 用，對于維護眼睛和中樞神經系統健康，增強免疫系統功能、強化肌體能量代謝、抗癌、抗感 染等具有多重功效。
[0003]目前利用雨生紅球藻生產天然郵青素是最主要的生產方法，但面臨著成本高、生 產效率低且不穩定、易生物污染等技術瓶頸的制約。小球藻C.zofingiensis是一種單細胞 綠藻，細胞直徑為2-15ym，在高光、低氮誘導條件下可W顯著提高胞內郵青素含量，是生產 天然郵青素的一種重要的替代性微藻種質。近年來研究表明，小球藻C.zofingiensis能夠 在黑暗條件下利用有機物進行異養高密度發酵，經高光、高溫、高鹽、氮磯限制等誘導條件 能高效積累郵青素。因此，開發針對小球藻C.zofingiensis胞內色素尤其是郵青素進行檢 測分析的技術，對于采用小球藻生產郵青素等類胡蘿h素具有重要意義。
[0004] 目前分析測定郵青素的傳統方法是紫外-可見分光光度計法扣V-vis)、高效液相 色譜法0PLC)等。但該兩種方法其檢測效率還不夠理想，需要對藻細胞中的郵青素事先 提取，而后針對提取物來檢測郵青素含量，該樣不僅增加了檢測所需工序，而且所需時間較 長，降低了工作效率。
[0005] 開發一種可提高檢測效率、簡化檢測工序的小球藻郵青素檢測方法非常有必要。
【發明內容】
[0006] 為了彌補現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種快速無損檢測小球藻胞內 郵青素的方法。
[0007] 本發明為達到其目的，采用的技術方案如下：
[000引一種快速無損檢測小球藻胞內郵青素的方法，包括如下步驟：
[0009] 1)建立標準曲線---取多個郵青素含量已知的小球藻懸浮液已知樣品，用去離子 水或磯酸鹽緩沖液重懸從所述小球藻懸浮液已知樣品中收集到的藻細胞，調整為細胞密度 在6X105~2X10 6CFU/mL(個/mL)之間的藻細胞重懸液，用配備有488皿氣離子激光器的 流式細胞儀檢測藻細胞重懸液在FL1通道巧33/30nm帶通濾片）或FL2通道巧85/40nm帶 通濾片）的平均巧光強度值；將小球藻懸浮液已知樣品的郵青素含量的對數值和相應測得 的FL1或FL2通道的平均巧光強度值的對數值作線性回歸，得標準曲線；所述多個郵青素含 量已知的小球藻懸浮液已知樣品之間的郵青素含量不同。
[0010] 2)制備及檢測待測樣品---用去離子水或磯酸鹽緩沖液重懸從待測小球藻懸浮 液中收集到的藻細胞，調整為細胞密度在6X1〇5~2X10 6cFU/mL(個/mL)之間的待測藻細 胞重懸液，作為待測樣品；
[OCm] 3)用配備有488nm氣離子激光器的流式細胞儀檢測待測樣品在化1通道或FL2通 道的平均巧光強度值，根據步驟1)建立的標準曲線，算得待測樣品的郵青素含量。
[0012] 優選的，用流式細胞儀檢測樣品時，其進樣流速控制為14~100yL/min。
[001引更為優選的，進樣流速控制為35yL/min。
[0014] 進一步的，所述磯酸鹽緩沖液的濃度為lOmM，抑為6. 8~7. 6。
[0015] 優選的，樣品在用流式細胞儀檢測前還具有用孔徑5~40ym的水相濾膜或有機 相濾膜過濾的步驟；所述對數值為W10為底的對數。
[0016] 進一步的，步驟1)中所述已知樣品的郵青素含量通過HPLC法或紫外-可見分光 光度計法測得，可W采用本技術領域現有的HPLC法或紫外-可見分光光度計法或其他方法 測得。
[0017] 優選的，步驟1)中所述已知樣品的郵青素含量通過HPLC法測得，測定步驟包括：
[001引 a、HPLC法待測樣品制備---將小球藻懸浮液已知樣品凍干為藻粉，從藻粉中提取 獲得郵青素提取物，用甲醇和MTBE(甲基叔了基離）按照1:3~7:3的體積比混合的溶劑 溶解所述郵青素提取物；
[0019] b、HPLC法檢測條件---采用液相色譜儀檢測樣品，檢測波長為480nm，所用色譜柱 為YMC?C30 ;甲醇、甲基叔了基離和水分別為流動相A、B、C，W流動相A、B、C組成的洗脫液 進行梯度洗脫，流動相梯度洗脫程序及各流動相的體積百分比為：
[0020] 0-6min，流動相A95%- 80%、流動相B5 - 20%、流動相C0% ;
[0021] 6-12min，流動相A80 - 60%、流動相B20 - 38%、流動相C0 - 2% ;
[0022] 12-28min，流動相A60 - 50%、流動相B38 - 48%、流動相C2% ;
[0023] 28-33min，流動相A50%、流動相B48%、流動相C2%;
[0024] 33-35min，流動相A50 - 95%、流動相B48 - 5%、流動相C2 - 0%;
[0025] 35-38min，流動相A95%、流動相B5%、流動相C0%;
[0026] C、建立HPLC法標準曲線---用甲醇和MT邸按照1:3~7:3的體積比混合的溶 劑配制郵青素標準品溶液，對多個濃度梯度的標準品溶液按照步驟b的檢測條件檢測各濃 度的標準品溶液的液相峰面積，將液相峰面積和相應的標準品溶液濃度做線性回歸，繪制 HPLC法標準曲線；
[0027]t步驟a中制得的樣品經步驟b檢測得到液相峰面積，然后根據步驟C建立的 HPLC法標準曲線，算得所述已知樣品的郵青素含量。
[002引優選的，步驟b中，用液相色譜儀檢測時，柱溫箱溫度為25~35°C，洗脫液流速 控制為0. 5~1. 5血/min;所述液相色譜儀還配備有PDA檢測器，在檢測時，PDA檢測器在 480nm對郵青素進行檢測，同時在300~700nm對樣品進行全波長掃描。
[0029]優選的，步驟a中，郵青素提取物通過如下步驟獲得：將藻粉加入混合溶劑中，振 蕩，置于液氮中冷卻，離屯、收集上清液；沉淀再次加入所述混合溶劑中，振蕩，置于液氮中冷 卻，離屯、收集上清液，重復該步驟直至藻細胞呈無色為止；合并所有上清液，用氮氣吹干； 所述混合溶劑為含有0. 01~0. 2% (質量）添加物的由溶劑A和溶劑B混合而成的混合溶 劑，其中所述溶劑A選自二氯甲燒、正己燒中的至少一種，溶劑B選自甲醇、己醇中的至少一 種，所述添加物選自BHT(2，6-二叔了基-4-甲基苯酪）、BHA(了基哲基茵香離）、TB冊（特 了基對苯二酪）中的至少一種。
[0030] 優選的，所述混合溶劑中溶劑A和溶劑B的體積比為1:1~9:1。
[0031] 本發明提供的技術方案具有如下有益效果：
[0032] 本發明實現了小球藻胞內郵青素的快速無損檢測，極大地簡化了檢測步驟，在建 立標準曲線后，檢測樣品時無需對樣品進行提取操作，樣品前處理簡單，縮短了檢測時間， 同時非常適宜用于微藻細胞尤其是小球藻細胞內郵青素的快速無損檢測分析；
[0033] 流式細胞術（Flow切tometry)可在488皿下激發小球藻胞內的郵青素發射巧光， 并分別檢測小球藻細胞在533nm(FLl通道）和585nm(FL2通道）發射波長下的平均巧光強 度。本申請發明人意外的發現該兩個特定發射波長下的平均巧光強度與小球藻胞內郵青素 含量之間存在高度正相關性。通過測定該平均巧光強度，并與HPLC測定結果相匹配，可W 準確、快速、無損地反映郵青素積累情況。該方法與常規方法相比，可W大大提高檢測靈敏 度，檢測速率也更快。流式細胞術對發射巧光的細胞可W進行快速無損分析測定，在郵青素 快速檢測方面有著重要的應用價值。
【附圖說明】
[0034] 圖1為小球藻C. zofingiensis培養過程中生物量和郵青素積累規律；
[0035] 圖2中A、B、C各圖為培養起始、中間和結束時的小球藻細胞的光學顯微照片；
[0036] 圖3為培養起始和結束時小球藻細胞的FLU533nm)VS.細胞個數（Count)的流式 細胞分析圖；
[0037] 圖4為培養起始和結束時小球藻細胞的化2 (585nm)VS.細胞個數（Count)的流式 細胞術分析圖；圖3、圖4中虛線表示培養起始時的小球藻細胞，實線表示培養結束時的小 球藻細胞。FL1/FL2表示流式細胞儀化1/FL2通道的平均巧光強度值，Count表示細胞個 數。
[003引圖5為培養起始和結束時小球藻細胞的FSCVS.FLU533nm)流式細胞術分析圖；
[0039] 圖6為培養起始和結束時小球藻細胞的FSCVS.FL2巧85nm)流式細胞術分析圖；
[0040] 圖5、圖6中灰色點表示培養起始時的小球藻細胞，黑色點表示培養結束時的小球 藻細胞，FSC表示前向角散射光的測定值，FLU533nm)、FL2巧85nm)分別表示流式細胞儀 FL1、FL2通道的平均巧光強度值；
[0041] 圖7為小球藻C.zofingiensis培養過程中細胞平均巧光強度的變化規律；
[00創圖8為不同培養時間的小球藻C. zofingiensis胞內郵青素的液相色譜圖；
[0043] 圖9為小球藻細胞的平均巧光強度FL1與HPLC法測定的胞內郵青素含量的線性 回歸分析，MFI (Mean fluorescence intensity)表不平均巧光強度；
[0044] 圖10為小球藻細胞的平均巧光強度FL2與HPLC法測定的胞內郵青素含量的線性 回歸分析，MFI (Mean fluorescence intensity)表不平均巧光強度。