056]需要說明一下的是，本發(fā)明中的微球使用聚苯乙烯材料制成，微球通過接枝處理帶上于納米金顆粒電性相反的電荷，通過靜電作用使得納米金顆粒沉積在微球的表面；在量子點編碼過程中，量子點是通過滲透和擴散等方式嵌入到納米金顆粒層中并被吸附固定。
[0057]經(jīng)過納米金顆粒包被以及量子點標(biāo)記的微球，其結(jié)構(gòu)如圖2所示，包括微球01、納米級顆粒層02和量子點03。
[0058]具體實施例三
[0059]經(jīng)過納米金顆粒包被和量子點標(biāo)記的微球與M2-PK、K-ras、APC、AKT和PI3K的單克隆抗體偶聯(lián)。
[0060]此處以M2-PK單克隆抗體為例進行說明，而其他的單克隆抗體的偶聯(lián)與M2-PK單克隆抗體的偶聯(lián)一樣，此處不進行贅述。
[0061]把試管中含M2-PK單克隆抗體的濃度為50nmol/L，pH = 6.0的磷酸緩沖液在電磁攪拌下稀釋到30 μ g/mL，加入吐溫-80到I % (V/V)，然后把0.0lg量子點編碼納米金顆粒層包被的微球加入其中，繼續(xù)攪拌10分鐘，然后把5%的BSA溶液(1% )加入試管中以封閉沒有反應(yīng)完的位點，封閉完成后，對微球進行離心分離，再用PBS緩沖液洗滌，重復(fù)洗滌3次。經(jīng)過計算，探針的密度大約為0.01 μ g/g微球。
[0062]另外，以下將說明一下以本發(fā)明所制得的液相蛋白芯片的檢測方法:
[0063]a試劑盒置室溫平衡30min，加樣前充分混勻各試劑。
[0064]b在反應(yīng)板上依次加入反應(yīng)緩沖液、血清樣本(或標(biāo)準(zhǔn)品)20 μ I/孔，微球懸液20 μ I/孔，充分混勻。
[0065]c 37°C孵箱避光反應(yīng)45min。
[0066]d取出反應(yīng)板加PE標(biāo)記二抗溶液充分混勻，37°C孵箱避光反應(yīng)30min后，每孔加終止液80 μ I后充分混勻。
[0067]e置Luminex 200多功能流式分析儀上讀數(shù)，用配套軟件擬合劑量一反應(yīng)曲線，計算被檢血清樣本中各項檢測指標(biāo)的濃度。
[0068]再者，本發(fā)明所述的液相蛋白芯片可以得到以下的應(yīng)用:
[0069](I)液相蛋白芯片技術(shù)將液相蛋白芯片與流式細(xì)胞術(shù)充分結(jié)合，以熒光微球為反應(yīng)載體，反應(yīng)體系為液體，可同時檢測100個以上的指標(biāo)。
[0070](2)本發(fā)明可以同時檢測M2-PK、APC、K-ras, AKT和PI3K等多個結(jié)直腸癌的標(biāo)記物，且可以檢測血樣本、糞便、尿液、唾液等分泌物。
[0071]根據(jù)上述說明書的揭示和教導(dǎo)，本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以對上述實施方式進行變更和修改。因此，本發(fā)明并不局限于上面揭示和描述的【具體實施方式】，對本發(fā)明的一些修改和變更也應(yīng)當(dāng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。此外，盡管本說明書中使用了一些特定的術(shù)語，但這些術(shù)語只是為了方便說明，并不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。
【主權(quán)項】
1.一種聯(lián)合檢測五個結(jié)直腸癌標(biāo)記物的液相蛋白芯片，其特征在于:包括直徑和材料相同的隨機排列在微通道內(nèi)的第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球； 所述第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球均包被有納米金顆粒層并且該納米金顆粒層嵌設(shè)有量子點，其中每種微球的納米金顆粒層中嵌設(shè)的量子點的發(fā)射波長互不相同； 所述第一微球通過共價方式偶聯(lián)M2-PK單克隆抗體形成M2-PK量子點熒光探針，所述第二微球通過共價方式偶聯(lián)K-ras單克隆抗體形成K-ras量子點熒光探針，所述第三微球通過共價方式偶聯(lián)APC單克隆抗體形成APC量子點熒光探針，所述第四微球通過共價方式偶聯(lián)AKT單克隆抗體形成AKT量子點熒光探針，所述第五微球通過共價方式偶聯(lián)PI3K單克隆抗體形成PI3K量子點熒光探針。
2.如權(quán)利要求1所述的聯(lián)合檢測五個結(jié)直腸癌標(biāo)記物的液相蛋白芯片，其特征在于:所述第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球為帶電性的微球，并且納米金顆粒層是通過第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球的電性吸引沉積在各自的表面上。
3.如權(quán)利要求1所述的聯(lián)合檢測五個結(jié)直腸癌標(biāo)記物的液相蛋白芯片，其特征在于:所述第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球的球面經(jīng)過羧基處理或者生物素化處理以方便形成量子點熒光探針。
4.如權(quán)利要求1所述的聯(lián)合檢測五個結(jié)直腸癌標(biāo)記物的液相蛋白芯片，其特征在于:所述M2-PK單克隆抗體、APC單克隆抗體、AKT單克隆抗體、PI3K單克隆抗體和K_ras單克隆抗體分別通過M2-PK雜交瘤細(xì)胞、APC雜交瘤細(xì)胞、AKT雜交瘤細(xì)胞、PI3K雜交瘤細(xì)胞以及K-ras雜交瘤細(xì)胞注射在不同的小鼠體內(nèi)形成的腹水制備而得。
5.如權(quán)利要求5所述的聯(lián)合檢測五個結(jié)直腸癌標(biāo)記物的液相蛋白芯片，其特征在于:所述金膠體的粒徑為18-22nm，其中金的濃度為0.lmg/ml。
6.如權(quán)利要求1所述的聯(lián)合檢測五個結(jié)直腸癌標(biāo)記物的液相蛋白芯片，其特征在于:所述第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球表面接枝有羧基，并通過該羧基與所述量子點固定連接。
7.一種制備方法，用于制備權(quán)利要求1至權(quán)利要求7之一所述的液相蛋白質(zhì)芯片，其特征在于，包括步驟: A:活化處理，各取400 μ I第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球進行活化處理； B:納米金包被，各取0.25g經(jīng)過活化處理的第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球分別加入膠體金中，離心處理使得第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球的外表面包被納米金顆粒層； C:量子點標(biāo)記，將經(jīng)過步驟B處理的第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球分別加入2mL量子點中振蕩15分鐘，得到量子點標(biāo)記的第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球，其中每種微球所使用的量子點的發(fā)射波長互不相同； D:探針偶聯(lián)，各取經(jīng)過步驟C處理的第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球0.0lg分別加入到含有M2-PK單克隆抗體、APC單克隆抗體、AKT單克隆抗體、PI3K單克隆抗體和K-ras單克隆抗體的濃度為30 μ g/mL的磷酸緩沖液中進行偶聯(lián)，偶聯(lián)后用PBS緩沖液洗滌得到液相蛋白芯片。
8.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于:B的具體步驟為，在五個1mL離心管中加入分別加入0.025g第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球，以及各加入0.2?0.4mg的金膠體，振蕩2h后，離心處理，得到具有納米金顆粒層的微球，并用蒸餾水和乙醇分別洗滌3次，在室溫干燥后備用。
9.如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于:C的具體步驟為，各取0.25g的微球各自加入到含有體積比為5%的丁醇和體積比為95%的氯仿的混合溶液中，然后加入2mL含有不同比例量子點的溶液，室溫下攪拌2h，過濾分離出微球并用乙醇洗滌數(shù)次，干燥。
10.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于:D步驟具體為，向試管中加入含M2-PK單克隆抗體的磷酸緩沖液，并在電磁攪拌下將其稀釋到30 μ g/mL,加入吐溫T-80到I % (V/V)，然后把0.0lg經(jīng)過步驟C處理的第一微球加入其中，繼續(xù)攪拌10分鐘，然后把5 %的BSA溶液加入試管中以封閉沒有反應(yīng)完的位點；待封閉完成后，對微球進行離心分離，再用PBS緩沖液洗滌，重復(fù)洗滌3次;APC單克隆抗體、AKT單克隆抗體、PI3K單克隆抗體和K_ras單克隆抗體的偶聯(lián)依照上述的方法處理。
【專利摘要】本發(fā)明公開了聯(lián)合檢測五個結(jié)直腸癌標(biāo)記物的液相蛋白芯片及制備方法，其屬于液相蛋白芯片的技術(shù)領(lǐng)域。該液相蛋白芯片包括經(jīng)過羧基功能化或者生物素華的聚苯乙烯微球，在微球上包被納米金顆粒層以及在納米金顆粒層嵌設(shè)量子點，其中選擇五種標(biāo)記了不同發(fā)射波長的量子點的微球分別偶聯(lián)M2-PK、K-ras、APC、AKT和PI3K的單克隆抗體。通過該技術(shù)，能夠同時檢測結(jié)直腸癌的M2-PK、K-ras、APC、AKT和PI3K標(biāo)記物，可用于檢測結(jié)直腸癌的早期事件，靈敏度高，特意性強，檢測方法可靠。
【IPC分類】G01N33-68
【公開號】CN104865383
【申請?zhí)枴緾N201510017325
【發(fā)明人】何鳳屏
【申請人】深圳市森塔醫(yī)療器械有限公司
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2015年1月12日