聯合檢測五個結直腸癌標記物的液相蛋白芯片及制備方法
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及液相蛋白芯片的技術領域，尤其是涉及能夠同時檢測五個結直腸癌的特異性標記物的液相蛋白芯片。
[0002]本發明涉及的另外一個方面就是液相蛋白芯片的制備方法。
【背景技術】
[0003]結直腸癌是世界上常見的三大惡性腫瘤之一，其死亡率排第三位，近年來，隨著人們生活水平的提高以及飲食結構的改變，其發病率呈明顯上升趨勢。但是，目前國內外對結直腸癌的早期診斷仍處于較低水平，約半數的患者明確診斷時已進入中期和晚期結直腸癌。因此，提高結直腸癌的早期診斷是目前國內外迫切需要解決的關鍵問題。
[0004]目前早期診斷結直腸癌有以下幾種的常用技術:
[0005](I)大便隱血試驗是結腸癌常用的篩查方法，操作簡便、無創，主要缺點是靈敏度低、特異性差。
[0006](2)電子結腸鏡(簡稱內鏡)是發現及診斷結直腸癌最有效的手段，也是目前早期診斷結直腸癌的主要方法，尤其是在高危人群的檢查具有重要的臨床價值。因其為創傷性檢查伴有出血、腸穿孔等危險的副作用、且需要一定的設備和儀器，對操作人員的專業水平要求較高，故在大范圍人群的檢查存在著很大的局限性。
[0007](3)電化學發光技術檢測常用腫瘤標記物:如CEA、CA199、CA242、CA50，因其陽性率低，缺乏特異性(66.7% )，不合適用于結直腸癌的早期診斷。
[0008](4)采用PCR技術檢測患者血清或糞便內的DNA和檢測微小RNA的濃度對結直腸癌治療監測和預后評價有一定的價值，但它們在應用于結直腸癌的早期診斷方面還有待于進一步研宄。
[0009]近年來，國內外學者開始致力于尋找敏感、特異、可靠、有效的結直腸癌新生物標記物以及建立無創傷性檢查和發明方法來提高早期診斷結直腸癌的診斷率。
[0010]有研宄顯示，M2型丙酮酸激酶(M2-PK)在胃腸腫瘤的發生、發展和代謝中發揮重要的作用。與正常組織相比，胃癌組織中M2-PK表達升高，與患者低生存率相關。國外學者認為腫瘤M2-PK在血漿、糞便檢測其靈敏度(90.7% )和特異性(96.3% )較高，且與疾病分期和淋巴結轉移相關，有望成為結直腸癌新型腫瘤標記物，尤其是在糞便的檢測其臨床價值更大。M2-PK主要以兩種形式存在，即高活性的四聚體形式和低活性的二聚體形式。前者主要存在于分化的組織和正常增殖的細胞中，而后者常存在于腫瘤細胞中，與底物親和力低，促使腫瘤細胞內糖代謝中間體如磷酸烯醇類物質等積累，對腫瘤細胞的增殖具有重要作用。結直腸癌是一種多基因性疾病，在發生發展過程中涉及到相關基因的改變如:K-ras、APC等基因突變。國外學者報道K_ras基因突變與結直腸癌密切相關，是結直腸癌的早期分子事件。APC基因突變與早期結直腸癌和腺瘤的診斷有較大的臨床價值，尤其是在高危人群早期診斷具有重要意義。近年來我國學者提出富含亮氨酸重復測序G蛋白耦聯受體5 (LGR5)，是一種干細胞分子標記物，也是Wnt信號通路的靶基因之一，其表達量的增加能夠促進胃腸黏膜的自我更新，LGR5在結直腸癌組織中呈高水平的表達。
[0011]目前有研宄提出AKT和PI3K基因突變可作為腫瘤的早期診斷、確定腫瘤的浸潤范圍以及判斷預后的重要指標。近年來，有研宄表明MXRAS有可能成為對大腸癌前病變早期診斷的有實用價值的腫瘤標記物。由于結直腸癌在遺傳學上是多步驟、多階段、多基因改變的過程，多基因聯合檢測對提高檢出率及檢測敏感性更有重要意義，故本項目根據病人的需要可單指標或多指標聯合檢測，在結直腸癌早期診斷和篩查中發揮重要作用。本項目研發的試劑成本較低以及病人支出的費用也得到降低，符合我國新醫改醫療計劃中對加強基層醫院和社區醫療服務中心的要求。
[0012]另外，隨著量子技術的發展，越來越適應生物化學、分子生物學、細胞生物學、基因組學以及蛋白質組學等研宄。特別的，量子點納米標記熒光不僅能特異性靶向腫瘤部位，還能通過熒光強弱反映出其活躍程度，可應用于腫瘤的早期診斷和監測療效。
[0013]現有的技術中，關于結直腸癌的檢測基本都是基于單個標記物指標進行檢測或者只是針對量子編碼微球、或者針對結直腸癌的后期檢測診斷，難以滿足社會發展的需要。
[0014]例如中國專利公告號為中國專利申請號CN100342034C披露了-種大腸癌蛋白標記物平行檢測液相芯片及其制備的方法，測定球形基質上結合的報告熒光分子的數量，用于間接確定球形基質上結合的大腸癌蛋白。提出生物芯片技術可以實現把多個結直腸癌的蛋白表達進行一次檢測。不足之處是:該申請號專利只對大腸癌蛋白標記物平行檢測液相芯片及其制備的方法進行描述，沒有研宄成熟的早期診斷結直腸癌的特異性標記物，缺乏專一性。
[0015]中國公告號為CN 1164238A披露了一種對人結腸癌相關蛋白抗原的單克隆抗體，是特異性對人類具有免疫原性的結腸癌相關抗原的糖蛋白抗原的鼠/人嵌合抗體可用于人結腸癌、乳癌和卵巢癌的免疫診斷。該專利沒有成熟的早期診斷結直腸癌標記物，缺乏專一性。
[0016]中國專利公告號為CN 101003835B披露了一種用于大腸癌檢查的基因組合的檢測方法，該方法通過在基因群中的至少2種以上的基因或者基因產物的表達量，篩選檢測樣品中的大腸癌細胞。該專利同樣存在不足:(1)通過銷售商業的基因芯片，價格昂貴，不適合臨床的廣泛應用。(2)使用多種技術:基因芯片、多重RT-PCR技術等，需要設計特異性探針和引物，操作繁瑣、費時費力，也不合適應用于臨床。(3)同樣存在沒有成熟的早期診斷結直腸癌標記物，缺乏專一"性。
【發明內容】
[0017]為了克服現有技術的不足，本發明的一個方面是提出一種聯合檢測五個結直腸癌標記物的液相蛋白芯片，其目的解決現有的結直腸癌的檢測只能針對癌癥后期檢測，且針對性不強，檢測速度慢、檢測數據不準確等的問題。
[0018]為了解決上述的技術問題，本發明提出的基本技術方案為:包括直徑和材料相同的隨機排列在微通道內的第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球；
[0019]所述第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球均包被有納米金顆粒層并且該納米金顆粒層嵌設有量子點，其中每種微球的納米金顆粒層中嵌設的量子點的發射波長互不相同；
[0020]所述第一微球通過共價方式偶聯M2-PK單克隆抗體形成M2-PK量子點熒光探針，所述第二微球通過共價方式偶聯K-ras單克隆抗體形成K-ras量子點熒光探針，所述第三微球通過共價方式偶聯APC單克隆抗體形成APC量子點熒光探針，所述第四微球通過共價方式偶聯AKT單克隆抗體形成AKT量子點熒光探針，所述第五微球通過共價方式偶聯PI3K單克隆抗體形成PI3K量子點熒光探針。
[0021]本發明的另外一個方面即提供一種用于制備上述的聯合檢測五個結直腸癌標記物的液相蛋白芯片的方法。
[0022]具體的，其制備方法的步驟為:
[0023]A:活化處理，各取400 μ I第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球進行活化處理；
[0024]B:納米金包被，各取0.25g經過活化處理的第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球分別加入膠體金中，離心處理使得第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球的外表面包被納米金顆粒層；
[0025]C:量子點標記，將經過步驟B處理的第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球分別加入2mL量子點中振蕩15分鐘，得到量子點標記的第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球，其中每種微球所使用的量子點的發射波長互不相同；
[0026]D:探針偶聯，各取經過步驟C處理的第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球0.0lg分別加入到含有M2-PK單克隆抗體、APC單克隆抗體、AKT單克隆抗體、PI3K單克隆抗體和K-ras單克隆抗體的濃度為30 μ g/mL的磷酸緩沖液中進行偶聯，偶聯后用PBS緩沖液洗滌得到液相蛋白芯片。
[0027]本發明的有益效果是:
[0028]本發明所提出的聯合檢測五個結直腸癌標記物的液相蛋白芯片針對結直腸癌的M2-PK、K-ras、APC、AKT和PI3K標記物，能夠用于檢測結直腸癌的早期事件，靈敏度高，特異性強