數目和/或百分比和/或分 數）的方法中。
[0126] 本發明提供了檢測細胞樣品中的活細胞的方法。該方法包括將該細胞樣品中的細 胞（i)在允許一種可透過膜的熒光染料滲透活細胞與非活細胞兩者的條件下，暴露于該熒 光染料，并且（ii)在允許一種不可透過膜的熒光淬滅劑選擇性地滲透非活細胞而不是活 細胞的條件下，暴露于該淬滅劑，該淬滅劑能淬滅由該熒光染料產生的熒光。此后，該方法 包括將細胞暴露于一束具有能夠激發熒光染料產生熒光發射的波長的光，并且用一個檢測 器（例如，檢測單一波長范圍或多個不同波長范圍的單一檢測器）或多個檢測器（例如各 自能夠檢測不同波長范圍的不同檢測器）對來自細胞的熒光發射（如果有的話）進行檢 測，由此檢測細胞樣品中的活細胞。與活細胞內的熒光染料相比，在非活細胞內的熒光染料 發射顯著更少的熒光。因此，與活細胞相比，非活細胞發射顯著更少的熒光。
[0127] 在某些情況下，例如，當淬滅劑能夠產生熒光發射時，激發光的波長可以被選擇為 對該淬滅劑不進行光激發或基本上不進行光激發。可替代地，檢測器可以被選擇和/或配 置為優先檢測來自染料的發射事件而非來自淬滅劑的發射事件。
[0128] 此外，本發明提供了檢測細胞樣品中的活細胞的方法。該方法包括將該細胞樣品 中的細胞（i)在允許一種可透過膜的熒光染料滲透活細胞與非活細胞兩者的條件下，暴露 于該熒光染料，并且（ii)在允許一種不可透過膜的熒光淬滅劑選擇性地滲透非活細胞而 不是活細胞的條件下，暴露于該淬滅劑，該淬滅劑能淬滅由該熒光染料產生的熒光。此后， 這些細胞暴露于具有一個波長的光，該波長能夠激發熒光染料產生熒光發射。用一個或多 個檢測器對來自細胞的熒光發射（如果有的話）進行檢測，這些檢測器被配置為優先檢測 來自熒光染料的可檢測發射而不是來自淬滅劑的可檢測發射，從而使得來自淬滅劑的可檢 測發射（如果產生的話）不高于來自熒光染料的可檢測發射的50% (例如，不高于40%、 不不高于30%、不高于20%、不高于10% )。因此，在采用的檢測條件下，與活細胞相比，非 活細胞發射由檢測器檢測到的顯著更少的熒光。因此，該方法可以用于檢測細胞樣品中的 活細胞。
[0129] 在某些實施例中，在暴露于光時，非活細胞不發射或基本上不發射可由檢測器檢 測的熒光。在某些其他實施例中，在暴露于該束光時，非活細胞不發射或基本上不發射熒 光。
[0130] 應理解，適當的染料-淬滅劑對的選擇取決于多種因素，這些因素包括以下中的 一個或多個：染料的發射光譜，淬滅劑的吸收光譜，（如果淬滅劑具有發射光譜的話）淬滅 劑的發射光譜，以及在給定檢測器中的檢測帶寬。這些特征的每一個在下文討論。
[0131] 通常，在本方法的實踐中有用的示例性的可透過膜的熒光染料具有以下特征中的 一個或多個：當暴露于一束具有在從大約350nm至大約lOOOnm的范圍內的波長最大值的 光時是發熒光的，在具有或不具有表面活性劑如溫和洗滌劑或環糊精載體劑的情況下是水 溶性的，在可檢測的染色所需的濃度下時非毒性的，以及允許用于通過活細胞膜的被動擴 散的疏水特性。在某些實施例中，可透過膜的熒光染料還可以表征為包含至少一個帶電基 團（例如，季氮基團）。在某些實施例中，熒光染料可以被激發以經歷通過來自紅色激光器 (例如，發射具有在620nm至640nm范圍內的波長的光的紅色激光器）的輻照產生的熒光。
[0132] 此外，在本方法的實踐中有用的示例性的可透過膜的熒光淬滅劑具有以下特征中 的一個或多個：在足以淬滅來自熒光染料的信號的濃度下時非毒性的，水溶性的，親水性 的，以及包含任一高電荷基團（例如但不限于羧基、氨基、苯氧化物、硫酸鹽、磺酸鹽、磷酸 鹽、或膦酸鹽部分）和/或被極性配體（例如，聚乙二醇、聚丙二醇、或聚乙烯醇）取代的 為極性的，從而使得淬滅劑的極性防止通過活細胞膜的被動擴散和/或主動地被泵出活細 胞。在某些實施例中，不可透過膜的熒光淬滅劑可任選地包含至少兩個帶電基團（例如，至 少一個季氮基團）。在另一個實施例中，當由用于檢測活細胞存在的光源激發時，當暴露于 從可透過膜的熒光染料發射的具有一個波長、一個波長范圍、或多個波長范圍的光時，淬滅 劑不發熒光。
[0133] 示例性的熒光染料和熒光淬滅劑對可以被檢測用于在此描述的發明的實踐，并且 可以選自例如在下文表I和II中列出的熒光染料和熒光淬滅劑。
[0134] 示例性的熒光染料（e_受體）可以選自噁嗪1、噁嗪170、噁嗪750、噁嗪4、羅丹明 700、羅丹明800、甲酚紫、尼羅藍、亞甲基藍、天青A、天青B以及天青C，它們可以與一種示例 性淬滅劑（e^共體）組合使用，該淬滅劑選自：抗壞血酸鈉、5'鳥苷單磷酸鹽、L-色氨酸、六 氰合鐵（II)酸鉀、二苯胺-2-磺酸、銅酞菁_3,4'，4"，4"' -四磺酸四鈉鹽以及腐植酸。
[0135] 示例性的焚光染料（el共體）可以選自金屬化的酞菁或卟啉（porhyrin)、赫斯特 (Hoeschst)33342、以及其他赫斯特染料、Ru(phen_dppz2+和Rh(phi)bpy3+，它們可以與一 種淬滅劑（e_受體）組合使用，該淬滅劑選自：二吡啶鑰衍生物（例如，N，N' -二甲基-4， 4' -二吡啶鑰二氯化物、1，1' -乙烯-2, 2' -二吡啶鑰二溴化物、以及蒽醌（例如，雙烷基氨 基蒽醌）。
[0136] 表I-示例性熒光染料
[0137]
【主權項】
1. 一種檢測液體樣品中的活細胞的存在和/或數量的方法，該方法包括以下步驟： (a) 在將該液體樣品通過基本上平面的多孔膜之后，如果有的話對由該多孔膜的至少 一部分保留的活細胞用熒光標記物進行標記； (b) 通過相對于檢測系統旋轉所述多孔膜對所述多孔膜的所述部分進行掃描，該檢測 系統包括 (i) 光源，該光源發射一束具有一波長的光，該波長被適配為激發是焚光標記物產生發 射事件，以及 (ii) 至少一個檢測器，該至少一個檢測器能夠檢測所述發射事件， 由此查詢所述平面多孔膜的多個區域，并且檢測通過與任何活細胞相關聯的熒光標記 物的激發而產生的發射事件；并且 (c) 通過基于步驟（b)中檢測的發射事件確定由所述膜捕獲的活細胞的存在和/或數 量。
2. 如權利要求1所述的方法，其中，在步驟（a)中，使用活性染色劑和活性染色系統中 的至少一者將所述細胞進行標記。
3. 如權利要求1或2所述的方法，其中，該束光源發射具有在從大約350nm至大約 1000 nm范圍內的波長的光。
4. 如權利要求3所述的方法，其中，所述波長至少在從大約350nm至大約600nm和從大 約600nm至大約750nm的范圍內。
5. 如權利要求1至4中任一項所述的方法，其中，所述檢測器檢測處于從大約350nm至 大約1000 nm范圍內的發射光。
6. 如權利要求5所述的方法，其中，所述光學檢測器檢測處于選自以下的至少一個范 圍內的發射光：從大約350nm至大約450nm、從大約450nm至大約550nm、從大約550nm至大 約650nm、從大約650nm至大約750nm、從大約750nm至大約850nm、以及從大約850nm至大 約 950nm。
7. 如權利要求1至6中任一項所述的方法，其中，所述多孔膜包括圓盤。
8. 如權利要求1至7中任一項所述的方法，其中，當暴露于具有處于從大約350nm至大 約1000 nm范圍內的波長的光時，所述多孔膜基本上是非自發熒光的。
9. 如權利要求1至8中任一項所述的方法，其中，所述多孔膜具有高達大約100 ym的 平面度公差。
10. 如權利要求1至9中任一項所述的方法，其中，所述多孔膜限定了具有平均直徑的 多個孔，該平均直徑小于大約I Um從而允許流體穿過所述多孔膜同時將細胞保留在其上。
11. 如權利要求1至10中任一項所述的方法，其中，所述多孔膜具有處于選自下組的 范圍內的厚度，該組由以下各項組成：從I Um至3, 000 ym ;從10 ym至2, 000 ym ;以及從 100 y m 至 1，000 y m。
12. 如權利要求1至11中任一項所述的方法，其中，所述多孔膜布置于流體可滲透支撐 構件上。
13. 如權利要求12所述的方法，其中，所述支撐構件具有處于選自下組的范圍內的厚 度，該組由以下各項組成：從〇? 1謹至ICtam ;從〇? 5謹至5謹；以及從1謹至3謹。
14. 如權利要求1至13中任一項所述的方法，該方法進一步包括在所述多孔膜上捕獲 多種熒光顆粒，所述熒光顆粒在由來自所述光源的光激活時發射熒光事件。
15. 如權利要求1-14中任一項所述的方法，該方法進一步包括在所述液體樣品的至少 一部分中確定活細胞的數量。
16. 如權利要求1至15中任一項所述的方法，該方法進一步包括確定在所述可滲透膜 上的所述活細胞的位置。
17. 如權利要求1至16中任一項所述的方法，該方法進一步包括在步驟（c)后，在允許 由所述多孔膜捕獲的所述活細胞的生長和/或增殖的條件下培養所述多孔膜。
18. 如權利要求1至17中任一項所述的方法，其中，所述活細胞是微生物。
19. 如權利要求1至18中任一項所述的方法，該方法進一步包括對所述活細胞的屬和 /或種進行鑒定。
20. 如權利要求1至19中任一項所述的方法，其中，所述掃描步驟（b)包括用該束光示 蹤所述多孔膜上的嵌套圓形圖案和螺旋圖案中的至少一個。
21. 如權利要求1至20中任一項所述的方法，其中，在步驟（a)之前，在步驟（a)期間， 或在步驟（a)之前和期間，在允許細胞增殖的條件下對所述活細胞進行培養。
22. 如權利要求21所述的方法，其中，在允許細胞增殖的條件下對布置于所述多孔膜 上的所述活細胞進行培養。
23. 如權利要求1至22中任一項所述的方法，其中，在步驟（a)之后但是在步驟（b)之 前，在允許細胞增殖的條件下對所述活細胞進行培養。
【專利摘要】本發明涉及一種用于確定液體樣品中的活細胞的存在和/或量的方法。
【IPC分類】G01N33-58, G01N33-542, G01N33-569
【公開號】CN104755931
【申請號】CN201380035732
【發明人】諾爾曼·R·韋恩賴特, 巴拉·S·曼尼亞, 埃里克·斯廷普森, 布瑞恩·J·科洛尼亞, 羅伯特·K·科洛尼亞
【申請人】查爾斯河實驗室公司, 麗美特利克斯公司
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2013年5月2日
【公告號】EP2780707A1, US20130323745, WO2013166337A1