用于檢測細胞樣品中的活細胞的方法
【專利說明】用于檢測細胞樣品中的活細胞的方法
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年5月2日提交的共同未決的美國臨時專利申請號61/641，809 和2013年3月14日提交的共同未決的美國臨時專利申請號61/784, 789的優先權和權益， 將各申請的全部內容通過引用結合在此。 發明領域
[0003] 本發明大體上涉及一種用于確定液體樣品中的活細胞的存在和/或量的系統和 方法。
[0004] 背景
[0005] 例如由革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、以及真菌（例如酵母菌和霉菌）造成的微生 物污染可以導致嚴重的疾病，并且在一些情況下甚至導致人類和動物受試者中的死亡。在 某些產業例如食品、水、化妝品、制藥、以及醫療器械產業中的生產商必須符合嚴格的標準 驗證他們的產品不包含一定水平的微生物污染物，否則會損害消費者或接受者的健康。這 些產業需要針對微生物污染物的存在進行頻繁的、準確的、靈敏的測試，以符合某些標準， 例如由美國食品與藥品管理局或環境保護局規定的標準。
[0006] 取決于情況，區分活細胞與非活細胞的能力還可以是重要的。例如，在藥物制劑和 生物制劑的生產期間，重要的是在生產過程中使用的水是無菌的并且不含污染物。并且，重 要的是在藥物（例如，液體藥物制劑和生物劑型，例如可注射的劑型）中包含的水以及例如 經由非腸胃外途徑給予至受試者的液體（例如，鹽水）也是無菌的并且不含污染物。在另一 方面，在飲用水中一些活微生物的存在可以被接受為直到達到一個點。為了適于飲用，飲用 水必須符合嚴格標準。即使微生物可以存在于供水中，該水可依然對于人類消費來說是可 接受的。然而，一旦細胞數超過一個閾值水平，該水可能不再被視為對人類消費是安全的。 并且，在某些食物產品（例如，生鮮產品）和飲品（例如，牛奶）中某些預定水平的微生物 的存在可以是可接受的。然而，一旦已經超過那些水平，食物或飲品可被視為已經變質并且 對于人類消費不再安全。
[0007] 用于評估微生物污染的存在和/或微生物污染的程度的傳統的細胞培養方法可 以耗費幾天來進行，這取決于測試針對的微生物。在此期間，存在懷疑的產品（例如，食物、 飲品、或醫療產品）可以被檢疫隔離，直至結果獲得并且產品可以釋放。因此，存在一種快 速檢測（例如，在數小時之內或更短）樣品中的微生物污染物特別是活的微生物污染物的 存在和/或量的系統和方法的需求。
[0008] 概述
[0009] 本發明部分地是基于檢測液體樣品中的活細胞（例如，原核細胞或真核細胞）的 存在和/或數量的方法的發現。該方法可以與一種細胞捕獲系統和/或光學檢測系統組合 使用以檢測細胞樣品中活細胞的存在。該方法可以用于一種用以測量感興趣的特定樣品的 生物負載（例如，用以測量活細胞（例如，活的微生物，如細菌、酵母菌、以及真菌）的數目 和/或百分比和/或分數）的方法中。
[0010] 在一方面，本發明提供了一種檢測液體樣品中的活細胞的存在和/或數量的方 法。該方法包括：(a)在將有待測試的該液體樣品通過一種基本上平面的多孔膜之后，對由 該基本上平面的多孔膜的至少一部分保留的任何活細胞用一種熒光標記物進行標記；(b) 通過相對于一個檢測系統旋轉該多孔膜對該多孔膜的該部分進行掃描，該檢測系統包括 (i) 一個光源，該光源發射一束具有一個波長的光，該波長被適配為激發該熒光標記物產生 一個發射事件，以及（ii)至少一個檢測器，該至少一個檢測器能夠檢測該發射事件，由此 查詢該平面多孔膜的多個區域，并且檢測通過與任何活細胞相關聯的熒光標記物的激發而 產生的發射事件；并且（c)通過基于步驟（b)中檢測的發射事件確定由該膜捕獲的活細胞 的存在和/或數量。
[0011] 該掃描步驟可以包括用該束光示蹤該多孔膜上的嵌套圓形圖案和螺旋圖案中的 至少一個。應理解的是在該掃描步驟期間，該多孔膜可以移動（例如，經由直線平移和/或 圍繞一個旋轉軸旋轉），同時該檢測系統保持靜止。可替代地，該檢測系統可以移動（例如， 經由直線平移），同時該多孔膜圍繞單個點旋轉（例如該多孔膜圍繞旋轉軸在單個位置處 旋轉）。可替代地，可能的是多孔膜和檢測兩者可以移動并且它們的相對位置可以相對于彼 此來測量。
[0012] 在某些實施例中，在步驟（a)中，將這些細胞使用下文更詳細描述的活細胞染色 劑和/或活細胞染色系統進行標記。
[0013] 檢測方法可以在單一的細胞、細胞簇或細胞集落上進行。在某些情況下，例如，為 了增加測定的靈敏度，可以希望的是在將細胞暴露于熒光染料和熒光淬滅劑之前和/或期 間和/或之后，在允許細胞增殖的條件下培養細胞。包括生長培養基、溫度、培養持續時間 的選擇的培養條件可以被選擇為允許樣品中的至少一種細胞具有一次或多次細胞分裂。
[0014] 在某些實施例中，用于激發該熒光染料或這些熒光染料的該束光具有在以下的范 圍內的波長：從大約350nm至大約lOOOnm、從大約350nm至大約900nm、從大約350nm至大 約800nm、從大約350nm至大約700nm、或從大約350nm至大約600nm。例如，激發光的波長 是至少處于以下的一個范圍內：從大約350nm至大約500nm、從大約350nm至大約500nm、從 大約350nm至大約600nm、從大約400nm至大約550nm、從大約400nm至大約600nm、從大約 400nm至大約650nm、從大約450nm至大約600nm、從大約450nm至大約650nm、從大約450nm 至大約7〇〇nm、從大約500nm至大約650nm、從大約500nm至大約700nm、從大約500nm至大 約750nm、從大約550nm至大約700nm、從大約550nm至大約750nm、從大約550nm至大約 800nm、從大約600nm至大約750nm、從大約600nm至大約800nm、從大約600nm至大約850nm、 從大約650nm至大約800nm、從大約650nm至大約850nm、從大約650nm至大約900nm、從大 約700nm至大約850nm、從大約700nm至大約900nm、從大約700nm至大約950nm、從大約750 至大約900nm、從大約750至大約950nm或從大約750至大約lOOOnm。某些范圍包括從大 約350nm至大約600nm以及從大約600nm至大約750nm。
[0015] 取決于采用的一種或多種熒光標記物，光學檢測器可以檢測處于以下范圍內的 發射光：從大約350nm至大約lOOOnrn、從大約350nm至大約900nm、從大約350nm至大約 800nm、從大約350nm至大約700nm、或從大約350nm至大約600nm。例如，可以檢測處于以 下范圍內的焚光發射：從大約350nm至550nm、從大約450nm至大約650nm、從大約550nm 至大約750nm、從大約650nm至大約850nm、或從大約750nm至大約950nm、從大約350nm至 大約450nm、從大約450nm至大約550nm、從大約550nm至大約650nm、從大約650nm至大約 750nm、從大約750nm至大約850nm、從大約850nm至大約950nm、從大約350nm至大約400nm、 從大約400nm至大約450nm、從大約450nm至大約500nm、從大約500nm至大約550nm、從大 約550nm至大約600nm、從大約600nm至大約650nm、從大約650nm至700nm、從大約700nm 至大約750nm、從大約750nm至大約800nm、從大約800nm至大約850nm、從大約850nm至大 約900nm、從大約900nm至大約950nm、或從大約950nm至大約lOOOnm。在某些實施例中，檢 測到處于以下范圍的發射光：從大約660nm至大約690nm、從大約690nm至大約720nm、和/ 或從大約720nm至大約850nm。
[0016] 該膜可以具有多種形狀的任何一種，例如，圓形、環形、卵形、方形、矩形、橢圓形 等，并且可以使一側的一些部分或全部暴露以用于細胞截留。并且，該膜可以在其中形成 一個或多個孔以適應一個掩罩，并且可以從若干分離的與該掩罩或其他結構元件組裝在一 起的膜形成。在一個實施例中，該膜可以處于圓盤的形狀，例如基本上呈平面的圓盤。取 決于所采用的檢測系統，多孔膜當暴露于具有一個處于從大約350nm至大約lOOOnm范圍內 的波長的光時基本上是非自發熒光的。并且，該多孔膜可以具有高達大約100Um的平面度 公差。并且，該多孔膜可以限定具有一個平均直徑的多個孔，該平均直徑小于大約lum從 而允許流體穿過該多孔膜同時將細胞保留在其上。該多孔膜可以具有一個處于選自下組的 范圍內的厚度，該組由以下各項組成：從1um至3, 000ym、從10ym至2, 000ym、以及從 100ym至 1，000ym。
[0017] 在某些實施例中，該細胞捕獲系統進一步包括一個流體可滲透支撐構件，該構件 與該膜的第二相對表面的至少一部分相鄰近。例如處于多孔塑料熔塊形式的流體可滲透支 撐物保留足夠的流體以將水分保留在布置于該可滲透支撐物鄰近處的多孔膜內，在某些實 施例中這對維持由多孔膜保留的細胞的活性而言可以是重要的。該支撐構件可以具有一個 處于選自下組的范圍內的厚度，該組由以下各項組成：從〇? 1mm至l〇mm、從〇? 5mm至5mm、以 及從1mm至3mm。
[0018] 此外，可能的是對于該檢測系統而言包括一種陽性對照。因此，該方法可以進一步 包括將該樣品中的細胞與多種熒光顆粒組合，這些熒光顆粒在由具有處于從大約350nm至 大約lOOOnm的范圍內的波長的光激活時發射一種熒光信號。此后，由熒光顆粒中的一個或 多個產生的熒光信號可以在由檢測系統檢測到任何活細胞的同時得以檢測到。
[0019] 該方法可以用于在該液體樣品的至少一部分中確定活細胞的數量。并且，該檢測 系統可以用于確定可滲透膜上的活細胞的一個或多個位置。為了測量并確定細胞的位置， 該細胞捕獲系統可任選地進一步包括一個登記器（register)(例如，線、點、或其他標記， 標戳或結構特征），該登記器與該膜關聯從而允許對保留在該平面膜的至少一部分上的細 胞的位置進行確定。對于圓盤形膜，極坐標（即，徑向"r"，以及角度" 0 "坐標定位）可以 是適合的。
[0020] 在檢測步驟之后，可以在允許由多孔膜捕獲的活細胞的生長和/或增殖的條件下 培養活細胞。活的生物的屬和/或種可以通過標準程序（例如，微生物染色和可視化程序） 或分子生物學程序（例如，擴增程序，包括聚合酶鏈式反應、連接酶鏈式反應、滾環復制等） 以及通過核酸測序來確定。
[0021] 通過參考以下說明書、附圖以及權利要求書，這些和其他對象連同在此披露的本 發明的實施