合圖。
[00巧]3. 3實驗條件的優化
[0056] 為了使開發出的傳感器實現最優的工作狀態，一些實驗參數需要進行優化，包括 適配體的濃度、反應時間、pH和檢測溫度。為了研究適配體濃度的影響，我們在NPG/GCE表 面固定不同濃度化1，0. 5, 1. 0, 2. 0, 5. 0, 8. 0, 10. 0, 12. 0 uM)的適配體。得到的aptamer/ NPG/GCE探針被浸于含有50 y M BPA的PBS溶液中。接著，通過DPV掃描結果來觀察不同濃 度的適配體對傳感器性能的影響。結果顯示在低濃度范圍內，響應電流隨著適配體濃度的 增大明顯增大。但是，當適配體濃度超過5.0 uM后，響應電流不再有明顯的增大。該是因 為電極表面用于固定適配體的活性位點已經達到了飽和。因此，在制備該電極的過程中，適 配體的最佳濃度為5. 0 y M。
[0057] 為了研究適配體探針與BPA的反應時間對檢測結果的影響，aptamer/NPG/GCE探 針分別在含有50yM BPA的PBS溶液中浸沒不同時間（0-35分鐘），再用DPV測試捕獲到的 BPA，便可獲得傳感器的響應電流和反應時間的關系。結果顯示響應電流在反應3min W后 出現，然后隨著反應時間的增加逐漸增大。但是在30min后由于能捕獲BPA的適配體位點 趨于飽和，峰電流不再出現明顯的增大。因此，aptamer/NPG/GCE與BPA溶液最佳的反應時 間應為30min。
[0058] 接下來，為了研究測試溶液的抑對傳感器響應電流的影響，我們將捕獲了 BPA的 探針置于不同抑巧.5到8.0)的PBS溶液中進行DPV掃描。在抑為5. 5到7. 5的范圍內， 電流值隨著抑值的增大而增大，當抑值大于7. 5后，電流值隨著抑值的增大而減小。最 大響應電流出現在抑為7, 5的實驗條件下，因此本實驗的所有工作都是在抑為7. 5的PBS 溶液中進行的。
[0059] 另外，檢測溫度（15到50°C )對反應電流的影響也被考慮到。當檢測溫度從15°C 上升到40°C的過程中，峰電流顯著增大。但是一旦溫度超過40°C，峰電流值急劇下降。該 一顯著的下降應該是由于NPG結構內部的熱效應導致的。考慮到NPG的穩定性，30°C被選 作最佳檢測溫度。
[0060] 3. 4BPA 的檢測
[0061]圖 4.處
[0062] 圖4. (A) aptamer/NPG/GCE傳感器對不同濃度的BPA溶液的DPV檢測結果（(a) 0， 化）0. 1，（C) 1. 0,（d) 10. 0,（e) 20. 0,（f) 50. 0,（g) 100. 0,化）150.0 nM);炬）aptamer/NPG/GCE 傳感器檢測不同濃度BPA得到的標準曲線。
[0063] 在優化的實驗條件下，aptamer/NPG/GCE探針被用來檢測PBS溶液中不同濃度的 BPA (0-150.0 nM) "DPV掃描結果如圖4. A所示，峰電流值隨著BPA濃度的增大而逐漸增大。相 對應的標準曲線在0.1 nM到lOOnM BPA濃度范圍內顯示了非常好的線性關系（見圖4. B)。 該線性關系可W用方程 Ip(yA) = (0.047 + 0. 007) + (0. 017 + 0. 00036KBPA] (nM)表示，其 相關系數為0.998。該傳感器的靈敏度為0.017 + 0. 00036 uA/nM。基于五組空白實驗數據 的標準偏差（置信水平為95%，k = 3，n = 5)，可計算出檢測限為0. 056 + 0. 004nM BPA。 該傳感器的線性范圍和檢測限與之前報道的電化學BPA傳感器進行了比較。我們發現該傳 感器的檢測限低于之前大多數的檢測方法。而且值得一提的是，和用納米金顆粒修飾的電 化學傳感器相比較巧引[17]，該傳感器的檢測限降低了接近100倍。該一結果歸功于NPG 雙向連續的納米結構，大大提高了傳感器的電傳導性。
[0064] 3. 5選擇性，重復性和穩定性
[0065]圖 5.處
[0066] 圖5.aptamer/NPG/GCE傳感器對不同分析物的DPV掃描結果圖。
[0067] 為了研究該傳感器的選擇性，我們選取了一些與BPA的結構、官能團相似的化合 物進行實驗，例如苯酪、對苯二酪、4, 4' -二哲基聯苯和雙酪B。aptamer/NPG/GCE探針分別 用來檢測lOOnM上述的化合物和lOnM BPA。圖5.顯示了 DPV掃描結果，對于苯酪、對苯二 酪、4, 4'-二哲基聯苯和雙酪B來說，該傳感器并未出現明顯的氧化還原峰。但是，該傳感器 檢測lOnM BPA時出現了非常明顯的氧化峰。該傳感器的出色的選擇性來自于適配體能可 靠地特異性識別BPA。
[0068] 為了考究該傳感器探針檢測的重復性，同一批制得的五支探針被用來檢測lOnM BPA溶液。該批傳感器的檢測結果的相對標準差巧SD)為6. 2%，顯示了良好的檢測重復性。
[0069] 通過先后對同一濃度BPA溶液的檢測來評估該傳感器探針的工作穩定性。首先， 在相同條件下制得一批aptamer/NPG/GCE傳感器探針。接著，用其中的S支探針來檢測 lOnM BPA溶液，其檢測平均值作為參考基準。其余的電極儲存于4°C條件下，每隔十天取立 支來檢測同一濃度的BPA。歷經兩個月，所得檢測結果并沒有隨時間不同發生明顯變化，該 顯示了該探針的穩定性是令人滿意的。
[0070] 3. 6實際樣品的分析
[ocm] 表1.對注入定量BPA的稀釋五倍的人體血清樣本的檢測結果
[0072]
【主權項】
1. 一種基于適配體修飾的納米多孔金的雙酚A傳感器，包括對電極、參比電極和工作 電極，其特征在于：所述的工作電極為表面修飾了雙酚A適配體/納米多孔金的玻碳電極， 制備方法如下： 1) 將玻碳電極GCE用氧化鋁粉末在麂皮革上研磨至鏡面拋光度，超聲洗滌后，再分別 用超純水和乙醇浸洗； 2) 將脫合金法制得的納米多孔金NPG平鋪到GCE表面，得到的NPG/GCE ; 3) 將活化后的BPA適配體滴至NPG/GCE上，靜置10-12h，使適配體通過S-Au鍵固定在 NPG上，即得aptamer/NPG/GCE傳感器探針。
2. 根據權利要求1所述的雙酚A傳感器，其特征在于：所述的對電極為鉑電極，所述的 參比電極為銀/氯化銀電極。
3. -種基于適配體修飾的納米多孔金的雙酚A傳感器的制備方法，其特征在于，具體 步驟如下： 1) 將玻碳電極GCE用氧化鋁粉末在麂皮革上研磨至鏡面拋光度，超聲洗滌后，再分別 用超純水和乙醇浸洗； 2) 將脫合金法制得的NPG平鋪到GCE表面，得到的NPG/GCE ; 3) 將BPA適配體滴至NPG/GCE上，靜置過夜，即得aptamer/NPG/GCE傳感器探針，并用 TE緩沖液洗滌后置于4°C的冰箱內儲存待用。
4. 如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟2)中，所述將NPG通過物理吸附作用平 鋪到GCE表面。
5. 如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟3)中，所述活化后的BPA適配體的滴加 量為0? 1~12yL。
6. 如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟3)中，所述BPA適配體的活化方法為 取100 y L、5. O y M適配體與10 y L、0. 5mM二硫蘇糖醇充分振蕩混合，活化15分鐘，然后用 100 y L乙酸乙酯對未反應的二硫蘇糖醇及其它副產物進行萃取分離，萃取三次，即得。
7. -種應用權利要求1或2所述的雙酚A傳感器檢測雙酚A濃度的方法，其特征在于， 包括以下步驟：將生物傳感器浸入待測樣品中，根據相應電流值與雙酚A濃度的定量關系， 確定待測樣品中雙酚A的濃度。
【專利摘要】本發明公開了一種基于適配體修飾的納米多孔金的雙酚A傳感器及方法，對雙酚A(BPA)進行了高靈敏度、高選擇性地直接電化學檢測。將金銀合金薄膜置于濃硝酸中腐蝕掉其中的銀，得到NPG膜。用NPG修飾玻碳電極，然后再修飾上BPA的適配體，制得傳感器。NPG對BPA的氧化還原反應表現出優異的電化學催化活性，從而確保了傳感器的高靈敏度。固定在NPG上的適配體大大提升了該傳感器的選擇性。被適配體捕獲的BPA在0.35V/0.28V處(相對于銀/氯化銀電極)顯示出氧化還原峰。本實驗對重要的實驗參數進行了優化。該檢測方法的線性檢測范圍為0.1nM到100nM，檢測限為0.056±0.004nM。值得一提的是，該傳感器已被成功應用于人血清樣本中BPA的檢測。
【IPC分類】G01N27-30, G01N27-26
【公開號】CN104749233
【申請號】CN201510149951
【發明人】朱燁, 閆妍, 周楚青, 閆旭鵬
【申請人】山東大學
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年3月31日