一種基于適配體修飾的納米多孔金的雙酚a傳感器及方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于電化學檢測領域，特別設及一種基于適配體修飾的納米多孔金的雙酪 A傳感器及方法。
【背景技術】
[0002] 雙酪A炬PA)是聚碳酸醋聚合物和環氧樹脂的合成過程中的一種重要的有機單 體，其廣泛存在于食品儲存和包裝材料中，包括嬰幼兒奶瓶、飲用水瓶、餐具和食品罐頭的 內部涂層等。隨著BPA在食品及環境領域的廣泛應用與滲入[1]，人們對BPA的危害性產 生了顧慮巧][3]。實際上，BPA是一種有害的內分泌干擾物質，因其結構與激素相類似，它 可W冒充雌激素并且干設雌激素與雌激素受體間的正常結合巧]，從而導致人體內分泌系 統素亂，尤其是對嬰幼兒和孕婦會產生明顯的危害[4]。最新的研究調查顯示，BPA與肥胖 癥、神經中毒、甚至是癌癥的病發都有潛在的關聯[5] [6]。因此，人體液中BPA的檢測對于 控制其對人體的危害有非常重要的意義。但是，生物樣本中基體效應的干擾加大了 BPA的 檢測難度。當下急需開發出一種快速的、簡便的、高靈敏度、高選擇性、穩定的檢測方法來檢 測人體液中痕量的BPA。
[0003] 當前BPA的檢測方法有很多，但是大多數都是基于色譜技術[7]，比如液相色譜 法巧]、高效液相色譜法巧]、液相色譜-質譜聯用法[10]和氣相色譜-質譜聯用法[11]。 近幾年，一些其他的檢測方法陸續被應用于BPA的檢測，如酶聯免疫吸附分析法巧LISA) [12]、分子印跡技術[13]、比色法[14]和電化學傳感器[1引等等。在該些已被報道的方法 中，電化學傳感器因其裝置低廉、操作簡便、檢測迅捷、操作成本低、靈敏度高、穩定性強、適 合于真實樣品的檢測等諸多優勢激發了廣泛的研究興趣[16]。由于BPA的電化學活性來 源于它的酪哲基，直接的電化學檢測成為了可能。為了加強檢測信號，具有電化學催化性能 的納米材料常被用于催化BPA的氧化還原反應，如納米金顆粒[17]、量子點[1引、碳納米管
[19]和石墨締[1引巧0]巧1]。但是，許多其他酪類物質的反應也會被上述的納米材料所催 化，從而干擾了 BPA的檢測。為了提高檢測的選擇性，一些生物分子被用來作為識別元件， 包括抗體巧2]、適配體巧3]、膚鏈巧4]和雌激素受體巧引。Ragavan等人指出BPA的檢測 迫切需要的是一種靈敏度高、選擇性好的簡便的傳感器[16]。因此，尋找一種兼具高效的電 催化作用和優異的生物兼容性的納米材料是發展BPA檢測方法的關鍵。
[0004] 脫合金法制備納米多孔金（NPG)自2004年被報道W來獲得了廣泛的關注巧6]。 NPG是一種雙向連續的多孔結構，納米孔和金骨架完全聯通，有一定的機械強度，化學性質 穩定、導電性出眾、生物兼容性良好。它所具備的高效的催化性質和光學性質已被廣泛地應 用于多個研究領域巧7]巧引。另外，它還對小分子物質展現出了優異的電催化性質巧9] [30]。但是，將具有優異的電催化作用的NPG和特異性生物分子識別元件相結合，用于設計 高靈敏度和高選擇性的電化學傳感器實現BPA的檢測，到目前為止從未被報道。基于NPG 的諸多優勢，其在電化學傳感器領域具有非常大的應用潛力和價值。
【發明內容】
[0005] 針對上述問題，我們開發了一種基于適配體修飾納米多孔金NPG的生物傳感器， 對雙酪A炬PA)進行直接電化學檢測。NPG用脫合金法制得，并用于修飾玻碳電極（GCE)。然 后，再用對BPA有特異性識別作用的適配體（aptamer)修飾NPG/GCE，傳感器的制備工作便 完成。我們用掃描電鏡法（SEM)和X射線光電子光譜法狂P巧對該傳感器的制備過程進行 了表征，并用循環伏安法（CV)對BPA在NPG/GCE上的電化學行為進行了研究。本實驗還對 一些重要的實驗參數進行了優化，包括適配體濃度、反應時間、抑和溫度。該一新型的傳感 器對于磯酸鹽緩沖溶液（PB巧中和實際樣品中的BPA濃度的檢測結果通過差分脈沖伏安法 值PV)獲得。
[0006] 為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
[0007] -種基于適配體修飾的納米多孔金的雙酪A傳感器，包括對電極、參比電極和工 作電極，所述的工作電極為表面修飾了雙酪A適配體/納米多孔金的玻碳電極，制備方法如 下：
[0008] 1)將玻碳電極GCE用氧化侶粉末在鹿皮革上研磨至鏡面拋光度，超聲洗漆后，再 分別用超純水和己醇浸洗；
[0009] 2)將脫合金法制得的納米多孔金NPG平鋪到GCE表面，得到的NPG/GCE;
[0010] 如將活化后的BPA適配體滴至NPG/GCE上，靜置10-12h，使適配體通過S-Au鍵固 定在NPG上，即得aptamer/NPG/GCE傳感器探針。
[0011] 優選的是，所述的對電極為銷電極，所述的參比電極為銀/氯化銀電極。
[0012] 本發明還提供了一種基于適配體修飾的納米多孔金的雙酪A傳感器的制備方法， 其特征在于，具體步驟如下：
[0013] 1)將玻碳電極GCE用氧化侶粉末在鹿皮革上研磨至鏡面拋光度，超聲洗漆后，再 分別用超純水和己醇浸洗；
[0014] 2)將脫合金法制得的，得到的NPG/GCE;
[0015] 3)將BPA適配體滴至NPG/GCE上，靜置過夜，即得aptamer/NPG/GCE傳感器探針， 并用TE緩沖液洗漆后置于4°C的冰箱內儲存待用。
[0016] 優選的是，步驟2)中，所述將NPG平鋪到GCE表面的具體方法是：用玻碳電極將 漂浮在水上的NPG膜撰起，使NPG膜吸附到玻碳電極表面。
[0017] 優選的是，步驟3)中，所述BPA適配體的滴加量為4~8 y L。
[0018] 一種應用上述的傳感器檢測雙酪A濃度的方法，包括W下步驟：將生物傳感器浸 入待測樣品中，根據相應電流值與雙酪A濃度的定量關系，確定待測樣品中雙酪A的濃度。
[0019] 本發明的有益效果；
[0020] 1.在該工作中，我們開發了一種基于NPG納米材料的適配體傳感器，用于BPA的直 接電化學檢測。該電極的檢測限低至0. 056 + 0. 004nM BPA，低于絕大多數已報道的電化學 檢測方法。該傳感器還對BPA顯示出了出色的選擇性和長期的穩定性。另外，該傳感器已 經成功應用于人血清樣本中BPA的檢測，該意味著其在臨床診斷領域有著值得矚目的應用 前景。
[0021] 2.本發明制備過程簡單、成本低，制備的檢測結果穩定性高，重現性和檢測精度 局。
【附圖說明】
[0022] 圖1. (a) NPG/GCE，（b) GCE，（C)金盤電極在含有200 y M BPA的PBS溶液中的CV掃 描圖，（d)NPG/GCE在PBS溶液中的CV掃描圖；內置圖為NPG/GCE在含有50 uM BPA的PBS 溶液中的多圈CV掃描圖。
[0023]圖2. NPG的沈M表征圖像（A和C)，aptamer/NPG的沈M表征圖像炬和D);似NPG/ GCE 和 aptamer/NPG/GCE 的 XPS 表征光譜圖；（F) (a)aptamer/NPG/GCE 和 〇3)BPA/aptame;r/ NPG/GCE在PBS溶液中的CV掃描圖。
[0024] 圖3. (A)在0. 1MPBS溶液中，BPA/aptamer/NPG/GCE在不同掃速下的CV圖，炬） 峰電流與掃速的線性擬合圖。
[00巧]圖4. (A)aptamer/NPG/GCE傳感器對不同濃度的BPA溶液的DPV檢測結果（(a) 0， 化）0. 1，（C) 1. 0,（d) 10. 0,（e) 20. 0,（f) 50. 0,（g) 100. 0,化）150.OnM);炬）aptamer/NPG/GCE 傳感器檢測不同濃度BPA得到的標準曲線。
[0026] 圖5.aptamer/NPG/GCE傳感器對不同分析物的DPV掃描結果圖。
[0027] 圖6.基于納米多孔金的適配體傳感器的制備流程及BPA直接電化學檢測原理
【具體實施方式】
[0028] W下通過實施例的方式進一步說明本發明，但并不因此將本發明限制在所述的實 施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規的方法和條件進行選 擇。實施例1
[002引1、實驗部分
[0030] 2. 1化學試劑與材料
[003。 BPA購于阿拉了試劑有限公司（中國，上海）。一種可W對BPA實現特異性識別的 5-琉基化 BPA 適配體保-CCG GTG GGT GGT CAG GTG GGA TAG CGT TCC GCG TAT GGC CCA GCG CAT CAC GGG TTC GCA CCA-3'K31]由 Invitrogen 生物科技有限公司（中國，北京） 合成制得。人血清樣品從健康的志愿者體內采集。PBS由0. 01M的磯酸氨二鋼、0. 0