0074] [圖16]是表示血清與合成抗原蛋白的抗原抗體反應信號值的圖。
[0075] [圖17]是概括各種血清與抗原蛋白的抗原抗體反應的圖。
[0076] [圖18]是表示健康人和患者血清與抗原蛋白的抗原抗體反應信號平均值和S/N 值的圖。
[0077] [圖19]是表示關于針對各種抗原蛋白的各血清的信號值而求得的ROC曲線和 AUC值的圖。
[0078][圖20]是表示血清與各種抗原蛋白（SU63株）的抗原抗體反應的圖。
[0079][圖21]是概括血清與抗原蛋白（SU63株）的抗原抗體反應的圖。
【具體實施方式】
[0080] 以下基于實施例對本發明進行更詳細的說明，但本發明不限定于這些實施例。
[0081] 在所有本實施例中都使用牙銀卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis)FDC381 菌株和SU63菌株作為牙周病原菌。FDC381菌株由住商醫藥國際（住商7 夕一 于シ3于少）株式會社售賣，SU63菌株可作為II型或IV型菌毛保有株獲得。
[0082] 抗體柱的制備 在人感染牙周病原菌時，人身體內通過免疫反應而產生針對牙周病原菌的抗原的多種 抗體。這里產生的抗體所識別的抗原因個體的免疫反應的差異而不同。
[0083] 因此，考察了在牙周病原菌的抗原制備液的組成中是何種抗原成為抗體的靶點， 基于其結果來篩選用于純化更多的抗原的血清。
[0084] 抗原蛋白的制備 將牙齦卟啉單胞菌（FDC381株和SU63株）超聲波粉碎，回收超離心后的上清組分，向 所得抗原制備液（株式會社特殊免疫研宄所、200 μ g蛋白質當量）中加入磷酸緩沖生理鹽 水（PBS)，使其達到270 μ 1。向其中加入三氯乙酸，在冰中靜置后，在低溫下進行離心，除去 上清。向該沉淀中加入冰冷乙醇進行清洗，再次在低溫下進行離心后，除去上清。然后進行 上述操作2次。風干后，加入添加有0. 06%的十二烷基硫酸鈉（SDS)的PBS 120 μ 1，將沉 淀溶解，針對各菌株分別配制抗原蛋白溶液。
[0085] 抗原蛋白的定量 在96孔板的孔中分別加入配制的標準物（濃度：1000、500、250、125、62. 5或31. 25ng/ μ 1)25 μ 1、用PBS稀釋的抗原蛋白溶液25 μ 1、作為對照的PBS 25 μ 1，接著在各孔中加入 蛋白質工作液（以Thermo scientific，Reagent Α:Β=50:1的用量混合）200 μ1。接著，用 搖床攪拌反應液，在恒溫恒濕機內于37°C孵育30分鐘后，用酶標儀（Intermed，NJ2000)測 定577nm的吸光度，對收集的抗原蛋白進行定量。
[0086] SDS-PAGE 電泳 對于經定量的牙齦卟啉單胞菌（FDC381菌株和SU63菌株）抗原蛋白，用各試樣緩沖液 (Invitrogen)配制成蛋白質濃度400ng/μ 1。將配制的試樣熱變性后，供于SDS-PAGE電泳 (蛋白質溶液5 μ 1)。
[0087] 對于SDS-PAGE電泳后的凝膠，用iBlot干式轉印系統（Invitrogen)在聚偏氟乙 烯膜（PVDF膜）上進行轉印。
[0088] 轉印至PVDF膜后，將電泳后的布局（layout)(分子量標準、FDC381株、SU63株） 作為一組切出。對于切出的一組狹條（slit)進行麗春紅染色，確認蛋白質的轉印。對于其 余的狹條，加入Falcon管中，浸漬于封閉溶液（添加有3%的脫脂牛奶和0· 1%的Tween20 的Tris緩沖生理鹽水（下稱"TBS"））中。
[0089] 使用血清的抗原抗體反應 對于封閉后的狹條，除去封閉溶液后，加入血清反應液（在添加有3%的脫脂牛奶的 TBS 20ml中加入從健康人或牙周病患者采集的血清8 μ 1而得的溶液），在室溫下振蕩。接 著，用添加有0. 05%的Tween20的TBS清洗狹條。清洗后，加入5000倍稀釋的結合有辣根 過氧化物酶的山羊抗人IgG抗體反應液（在添加有3%的脫脂牛奶的TBS中加入抗人二抗 (CHEMIC0N)而得的溶液），在室溫下振蕩。接著，用添加有0. 05%的Tween20的TBS清洗狹 條。清洗后，將狹條浸漬于含有〇. 6 lmg/mL的4-甲氧基-1-萘酚和0. 018%的過氧化氫水 的TBS，確認顯色后，用純水清洗，進行干燥。
[0090] 抗原蛋白與人血清的反應結果示于圖1。
[0091] 與健康人血清的抗原抗體反應中，幾乎未觀察到信號（圖IA:健康人對象血清）。
[0092] 另一方面，與牙周病患者血清的抗原抗體反應中，觀察到明確的信號，其圖樣多種 多樣（圖IB和圖1C)。此外，在與患者血清的抗原抗體反應中觀察到的多樣的信號大致可 分為兩類。即，分為顯示出明確的條帶的信號（圖1B)和顯示出整體擴散的模糊的信號（圖 1C)。多樣的抗原抗體反應圖樣是基于它們的大小的不同和對菌株的特異性的不同而形成 的。
[0093] 然后，如下所示大小的信號能在多數患者的血清中特異性地強烈觀察到。 46kDa(FDC381菌株和SU63菌株的抗原蛋白） 25-37kDa(FDC381菌株和SU63菌株的抗原蛋白） 100-1 IOkDa (FDC381菌株和SU63菌株的抗原蛋白） 57kDa(SU63菌株的抗原蛋白） 150-250kDa(SU63菌株的抗原蛋白）。
[0094] 由使用牙周病患者血清的抗原抗體反應的結果可見，大致可以觀察到兩種信號圖 樣（明確的條帶和整體擴散的模糊），通過它們的組合（大小、菌株）而形成多樣的抗原抗 體反應圖樣。即，這就表示，牙齦卟啉單胞菌感染癥產生的抗體多種多樣，有時用某種血清 能作為抗原蛋白識別、而用另一血清則完全無法識別。這與多樣的牙周病患者血清中所含 的抗體以多樣的蛋白質作為抗原這一報道不矛盾。因此表明，為了通過抗體效價來測定牙 齦卟啉單胞菌的感染，需要多樣的檢測抗原蛋白。
[0095] 此外，將FDC381菌株和SU63菌株中共有的抗原蛋白用于檢查時，認為菌株的鑒定 困難。另一方面，如果僅將對菌株有特異性的抗原蛋白用于檢查，則該檢查中顯示出陽性的 情況下，懷疑是該菌株的感染。
[0096] 患者血清中觀察到的抗原抗體反應圖樣多種多樣，但在初診患者（FV)和維護患 者（SPT)的圖樣中未觀察到顯著的差別。因此，鑒定在患者血清中顯示出強信號的抗原蛋 白，將其作為檢查中使用的抗原的候選。
[0097] 作為對于多數患者血清顯示出強信號的條帶，如結果所示，可例舉46kDa、 25-37kDa、100-110kDa、57kDa和150-250kDa的抗原蛋白組。于是，考察了這些蛋白組對于 各種患者的血清有無抗原性。其結果示于表1。
[0098] [表 1] 患者血清對抗原蛋白組的反應
【主權項】
1. 牙周病原菌血漿或血清抗體效價檢測試劑盒，其包含具有選自序列編號：151和155 中的一種或兩種氨基酸序列的多肽。
2. 權利要求1所述的牙周病原菌血漿或血清抗體效價檢測試劑盒，其中，所述多肽是 由選自序列編號：152和156中的一種或兩種多核苷酸序列編碼的多肽。
3. 牙齦卟啉單胞菌菌株的分型試劑盒，其包含具有選自序列編號：151和155中的一種 或兩種氨基酸序列的多肽。
4. 權利要求3所述的分型試劑盒，其中，所述多肽是由選自序列編號：152和156中的 一種或兩種多核苷酸序列編碼的多肽。
5. 多肽，其具有序列編號：151的氨基酸序列。
6. 權利要求5所述的多肽，其包含由序列編號：152的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。
7. 多肽，其具有序列編號：155的氨基酸序列。
8. 權利要求7所述的多肽，其包含由序列編號：156的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。
【專利摘要】本發明涉及一種牙周病原菌血漿或血清抗體效價檢測試劑盒。本發明的目的是提供能對具有大范圍的免疫表型的患者以高精度檢查牙周病、并且能用自動化的機器進行高速處理的、血液試樣中的針對牙周病原菌的抗體效價或抗體的檢測試劑盒，適合用于該試劑盒的牙周病原菌抗原蛋白，以及使用該試劑盒的檢測血液試樣中的抗體效價或抗體的存在的方法，對牙齦卟啉單胞菌菌株進行分型的試劑盒。本發明公開了包含具有序列編號：1、3、9、15、19、31、41、43、63、65和67的氨基酸序列的一系列多肽的檢測試劑盒，具有序列編號：67的氨基酸序列的改性多肽，以及測定從人身體中分離的血液試樣中的針對牙周病原菌的抗體效價或抗體的存在的方法，該方法包括使該血液試樣與上述一系列多肽接觸的步驟。
【IPC分類】G01N33-68, G01N33-569, C07K14-195, G01N33-543
【公開號】CN104730235
【申請號】CN201510069376
【發明人】野添干雄
【申請人】新時代株式會社
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2011年10月18日
【公告號】CN103443627A, EP2657703A1, EP2657703A4, US8975032, US20130316371, WO2012081306A1