定量測定乳品摻次程度的電泳滴定方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及的是生物分析技術和食品檢驗領域，具體涉及一種定量測定乳品摻次 程度的電泳滴定方法。
【背景技術】
[0002] 隨著社會經濟發展，人們更加青睞營養價值高的乳品，比如羊奶、驢奶和牛初乳 等。然而在利益驅使下，不法商家會往這類乳品中摻雜低成本的蛋白制品。比如，在驢奶中 摻雜牛奶（PizzanoR，SalimeiE.，2014,J.Agric.FoodChem.，62 (25)，5853-5858. )〇
[0003] 傳統的蛋白質含量測定方法有凱氏定氮法（Kjeldahl，J.Z.，1883,Anal.Chem.， 22, 366-382.)、BCA法（Smith，P.K.，Krohn，R.I.，Hermanson，etal，1985,Anal.Biochem.， 150, 76-85.)、雙縮脲法（Cole，E.R.，1969,Rev.PureandAppl.Chem.，19,109-130.)、 Folin酷法(Lowry, 0.H. ,Rosebrough,N.J. ,Farr,A. ,etal，1951，J.Biol.Chem.， 193, 265-275.)、光譜法（Kennedy，J.F.，White，C.A.，etal，1985,J.FoodChem.，18， 95-112.)、紫外吸收法（Layne，E.，1957,Method.Enzymol.，3,447-454.)以及考馬斯亮藍 法（Bradford，M.，1976,Anal.Biochem.，72, 248-254.)等。這些方法可以測定乳品的蛋 白質含量，但無法排除非蛋白氮（nonproteinnitrogen，NPN)的干擾（TerenceL.Fodey， ColinS.Thompson,ImeldaM.Traynor,etal，2011，Anal.Chem.，83,5012-5016.) 〇
[0004] 能夠排除NPN影響的蛋白質含量測定方法有親和色譜法（Goshe，M.B.，Conrads， T.P.，Panisko，etal，2001，Anal.Chem.，73, 2578-2586.)、親和毛細管電泳法（Armenta， J.M.，Gu，B.，Humble，etal，2005,J.Chromatogr.A，1097,171-178.)以及生物傳感器法 (Setford，S.J.，White，S.F.，Bolbot，etal，2002，Biosens.Bioelectron.，17, 79-86.)等。 由于特異性強，這些方法能夠用于對部分蛋白食品的檢測，但無法用于分析乳品是否摻次。
[0005] 目前，甄別乳品摻次的方法主要有聚丙烯酰氨凝膠電泳指紋圖譜法（ChrambachA， RodbardD.，1971，Science，172,440-451.)、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法 (ScMggcrH，VonJagowG.，1987,Anal.Biochem.，166,368-379.)、聚合酶鏈式反應法 (MafraI,FerreiraIM,FariaMA,etal.,2004,J.Agric.FoodChem.,52,4943-4947.) 和酶聯免疫吸附法（PizzanoR，SalimeiE.，2014,J.Agric.FoodChem.，62, 5853-5858) 等。前兩種方法是基于不同乳品的蛋白質指紋的差異進行鑒定，后兩種方法則基于乳品中 特定蛋白抗原和基因序列的存在實現甄別。因此，這些方法能夠定性檢測乳品是否摻次，但 無法定量檢測摻次程度。
[0006]為解決上述問題，Yang等人提出基于移動反應界面電泳滴定技術（moving reactionboundaryelectrophoresistitration,MRBET) (Q.Yang,L.Y.Fan,S.S.Huang, etal，Electrophoresis，2011，32,1015-1024.)。實驗證明，界面遷移速度（V)和濃度（C) 呈線性關系。在此之上，Wang等人設計出一種蛋白質電泳滴定技術（中國發明專利，專利 號ZL2012 1 0142985. 2)，利用V和C的線性關系來測量蛋白質含量。由于MRB是由H+和 蛋白質游離堿性殘基，或0JT和蛋白質游離酸性殘基建立而成，所以該技術可以排除NPN的 干擾。隨后，他們進一步建立了界面阻滯信號（R"rB)電泳滴定技術（WangH.，ShiY.，Yan J.，etal，2014,Anal.Chem. 86,2888-2894.)。實驗證明RMEB和蛋白質濃度（CPJ呈線性關 系。該技術可在不受NPN干擾的情況下測定樣品的蛋白質總含量，但該技術仍無法解決乳 品摻次的定量檢測問題。
【發明內容】
[0007] 針對上述技術存在的問題，本發明提供了一種測定乳品摻次程度的移動反應界面 電泳滴定方法（movingreactionboundaryelectrophoresistitration，MRBET)，具體為 一種定量測定乳品摻次程度的電泳滴定方法。本發明就是通過對已有的界面阻滯信號電泳 滴定技術（WangH.，ShiY.，YanJ.，etal，2014,Anal.Chem. 86, 2888-2894.)進行了創新 性的理論和技術發展，解決了原有電泳滴定技術只能檢測乳品蛋白質濃度，但無法定量測 定摻次程度的問題。
[0008] 本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：
[0009] 本發明涉及一種定量測定乳品摻次程度的電泳滴定方法，所述方法包括如下步 驟：
[0010] A、分別以未摻次的純乳品和摻入的蛋白質為標準品，進行MRBET滴定，利用MRB阻 滯信號R_與蛋白質濃度存在的線性關系建立兩條標準曲線，獲得所述純乳品的標準曲線 斜率ai、所述蛋白質的標準曲線斜率&2以及截距b;
[0011] B、采用與步驟A條件相同的MRBET滴定法，對摻次乳品進行MRBET滴定，獲得阻滯 信號Rmix;單位為s/m;測得摻次乳品的蛋白濃度Cmix，單位為mg/mL;
[0012] C、根據以下方程式獲得摻次乳品中所述摻入蛋白質和純乳品蛋白的濃度比值：
[0013] ^ ==::二=:，淇中，Cpro,i為摻次乳品中乳品的蛋白質濃度，單位為mg/mL， CPM,2為摻次乳品中摻入的蛋白質的濃度，單位為mg/mL。
[0014] 本發明的技術方案用于測定"已知種類未知比例"的樣品時，為定量方法，無需定 性。用于測定"未知摻入蛋白質種類及比例"的樣品時，可在MRBET滴定前使用聚合酶鏈式 反應法等方法確定其摻次乳品中的次等乳品（即摻入的蛋白質，如豆奶）。
[0015] 作為優先技術方案，步驟A中，建立標準曲線選用的系列蛋白質濃度為0mg/mL到 10mg/mL之間平均間隔選擇5到9個點。
[0016] 作為優先技術方案，步驟A中，純乳品的標準曲線方程式為：R_.iia ;摻 入的蛋白質的標準曲線方程式為：R_,2=a2C_,2+b;其中，R_,dP1?_,2分別為純乳品和摻 入蛋白的界面阻滯信號值，單位為s/m;CpM,dP(：_,2分別為純乳品和摻入蛋白的蛋白質濃 度，單位為mg/mL。
[0017] 作為優先技術方案，所述MRBET滴定中施加的電場為lV/mm~5V/mm。
[0018] 作為優先技術方案，所述MRBET滴定中采用的凝膠為聚丙烯酰胺凝膠，重量體積 濃度為10. 〇%~20. 0%，交聯度為3. 0%~6. 0%。
[0019] 作為優先技術方案，所述MRBET滴定中，采用的背景電解質溶液為離子強度從 20mmol/L到250mmol/L的氯化鈉或者氯化鉀溶液。
[0020] 作為優先技術方案，步驟A中，所述MRBET滴定為酸式MRBET滴定或堿式MRBET滴 定。
[0021] 作為優先技術方案，在酸式MRBET滴定中，陽極液是離子強度為20mmol/L~ 250mmol/L的鹽酸與氯化鈉或者氯化鉀的混合溶液，所述陽極液的離子強度和凝膠中的背 景電解質溶液的離子強度相同；陰極液為離子強度從20mmol/L~250mmol