本發(fā)明涉及通過高效液相色譜法檢測硼替佐米關(guān)鍵中間體1R-三氟醋酸鹽光學(xué)異構(gòu)體的方法，更具體的說是檢測1R-三氟醋酸鹽產(chǎn)品中1S-三氟醋酸鹽的方法。
背景技術(shù)：
硼替佐米是有美國Millenium制藥公司開發(fā)的，2003年經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)上市，用于治療多發(fā)性骨髓瘤。硼替佐米是一種合成的高選擇性26S蛋白酶體糜蛋白酶樣活性的可逆抑制劑，在單獨或聯(lián)合其它藥物時，與許多藥物合用呈協(xié)同或增敏作用，顯現(xiàn)出優(yōu)越的抗腫瘤作用和用藥的安全性。目前主要用于治療復(fù)發(fā)性與頑固性多發(fā)性骨髓瘤和套細(xì)胞瘤。
硼替佐米關(guān)鍵中間體1R-三氟醋酸鹽的1-位有一個手性中心，具有2個光學(xué)異構(gòu)體，其結(jié)構(gòu)式分別為：
分子式：C15H28BNO2·CF3COOH，分子量：379.22。
由于在制備1R-三氟醋酸鹽時不可避免的會生成1S-三氟醋酸鹽，在后續(xù)合成硼替佐米過程中1S-三氟醋酸鹽會發(fā)生類似反應(yīng)而生成硼替佐米異構(gòu)體雜質(zhì)，而該雜質(zhì)的生物活性遠遠低于硼替佐米。因此控制1R-三氟醋酸鹽中的1S-三氟醋酸鹽的含量對硼替佐米的質(zhì)量尤為重要。然而1R-三氟醋酸鹽結(jié)構(gòu)中沒有長共軛基團，因而無較強的紫外吸收，只有末端吸收，不便于準(zhǔn)確的檢測。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供通過高效液相色譜法準(zhǔn)確檢測硼替佐米關(guān)鍵中間體1R-三氟醋酸鹽中的1S-三氟醋酸鹽的含量，以便于后續(xù)控制硼替佐米的質(zhì)量。
本發(fā)明首先在1R-三氟醋酸鹽的1-位氨基上引入具有較強紫外吸收的苯甲酰基，制得苯甲酰衍生化1R-三氟醋酸鹽，然后再運用高效液相法采用多糖衍生物涂敷型手性色譜柱進行檢測，其固定相為表面涂敷有纖維素-三(4-氯-3-甲基苯基氨基甲酸酯)的球形硅膠。
流動相對實驗結(jié)果中苯甲酰衍生化的1R-三氟醋酸鹽和苯甲酰衍生化的1S-三氟醋酸鹽分離度及峰形均有很大影響，經(jīng)發(fā)明人實驗摸索，確定以正己烷-異丙醇-二乙胺(85～98∶2～15∶0.01～0.25，優(yōu)選為90～98∶2～10∶0.05～0.20，更優(yōu)選為95∶5∶0.1)為流動相效果很好。
本發(fā)明提供的通過高效液相色譜法檢測硼替佐米關(guān)鍵中間體1R-三氟醋酸鹽中1S-三氟醋酸鹽的方法具體條件如下：
1.樣品衍生化：運用常規(guī)合成方法在1R-三氟醋酸鹽的1-位氨基上引入苯甲?；?，制得苯甲酰衍生化的1S-三氟醋酸鹽。
2.色譜條件：色譜柱采用多糖衍生物涂敷型為固定相的手性柱；流動相為正己烷-異丙醇-二乙胺(85～98∶2～15∶0.01～0.25，優(yōu)選為90～98∶2～10∶0.05～0.20，更優(yōu)選為95∶5∶0.1)；檢測波長為235nm～260nm(優(yōu)選為240nm～255nm，更優(yōu)選為約245nm)；柱溫為20～45℃(優(yōu)選為30～40℃，更優(yōu)選為35℃)；流動相流速為0.5～2.0mL/min(優(yōu)選為0.8～1.2mL/min，更優(yōu)選為1.0mL/min)。
3.樣品溶液的配置：采用流動相將樣品配制為含硼替佐米關(guān)鍵中間體苯甲?；苌?R-三氟醋酸鹽0.1～2.0mg/mL的溶液(優(yōu)選0.1～1.0mg/mL，更優(yōu)選為0.5mg/mL)的溶液。
4.測定：將溶液注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，并進行分析。
采用此色譜條件測定苯甲酰衍生化后的1R-三氟醋酸鹽與苯甲酰衍生化后1S-三氟醋酸鹽分離度均超過1.5，符合中國藥典要求。此色譜條件同時可用于硼替佐米關(guān)鍵中間體1R-三氟醋酸鹽中1S-三氟醋酸鹽的定量。
附圖說明
圖1：按照實施例1的條件分離苯甲酰衍生化的1R-三氟醋酸鹽和苯甲酰衍生化1S-三氟醋酸鹽的高效液相色譜圖。
具體實施方式
實施例1.
樣品的處理：取供試品3g，苯甲酰氯1.5ml，二氯甲烷30ml置反應(yīng)瓶中，控制內(nèi)溫5～15℃下，滴加3mL三乙胺，滴畢，1小時后加入30ml水，分液，收集二氯甲烷層，無水硫酸鎂干燥，過濾，濃縮至干。殘留物通過100～200目硅膠柱層析(洗脫液：石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1)制得苯甲酰衍生化的1R-三氟醋酸鹽。1H-NMR(DMSO-D6，ppm)δ：0.84(s，3H，CH3)，0.89(s，3H，CH3)，0.90(s，3H，CH3)，1.23(s，3H，CH3)，1.30(s，3H，CH3)，1.36(m，2H，CH2)，1.46(d，1H，CH，J＝10Hz)，1.66(m，1H，CH)，1.86(m，2H，CH)，2.03(m，1H，CH)，2.21(m，1H，CH)，2.64(m，1H，CH)，4.07(m，1H，CH)，7.57(m，2H，CH)，7.65(m，1H，CH)，7.98(m，2H，CH)，10.00(s，1H，CH)，10.50(brs，1H，NH)；ESI(+)/70eV：370[M+H]+。
儀器：SHIMADZU LC-20AT高效液相色譜儀，SPD-20Avp紫外檢測器，OV-100柱溫箱；
色譜柱：CHIRAL CEL OX-H色譜柱(0.46×25cm，5μm)；
流動相：正己烷-異丙醇-二乙胺(95∶5∶0.1)
柱溫：35℃
流速：1.0mL/min
檢測波長：245nm。
定位溶液1的配制：精密稱取苯甲酰衍生化的1R-三氟醋酸鹽適量(按樣品處理方法制備)，用流動相溶解并稀釋成0.5mg/mL；
定位溶液2的配制：精密稱取苯甲酰衍生化的1S-三氟醋酸鹽適量(按樣品處理方法制備)，用流動相溶解并稀釋成0.5mg/mL；
混合樣品溶液的配制：精密稱取苯甲酰衍生化的1R-三氟醋酸鹽、苯甲酰衍生化的1S-三氟醋酸鹽適量，用流動相溶解并稀釋成含苯甲酰衍生化的1R-三氟醋酸鹽、苯甲酰衍生化的1S-三氟醋酸鹽各0.5mg/mL；
測定：取混合樣品溶液20μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，譜圖見圖1。苯甲酰衍生化的1R-三氟醋酸鹽、苯甲酰衍生化的1S-三氟醋酸鹽的分離度為4.8。