一種運用高效液相色譜法測定氨糖含量的方法與流程

技術領域：
本發(fā)明涉及一種測定氨糖含量的方法，特別是涉及一種運用高效液相色譜法測定氨糖含量的方法。
背景技術：
：氨糖的全稱是D-氨基葡萄糖，屬單糖成份，可從蟹蝦殼中萃取，是親水性極強的蛋白多糖的重要組成部分，是形成軟骨細胞的重要營養(yǎng)素之一，也是軟骨基質和關節(jié)液的基本成分，工業(yè)提取的氨糖分為D-氨基葡萄糖鹽酸鹽、D-氨基葡萄糖硫酸鹽、高純硫酸氨糖三種，廣泛用于骨關節(jié)疾病的預防和治療。最新醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)缺乏氨糖會直接導致各種骨關節(jié)疾病的發(fā)生，而氨糖流失的過程在人們35歲左右就已經(jīng)開始了。氨糖不僅控制著人體骨關節(jié)的健康，還控制著關節(jié)軟骨滑膜的代謝平衡。氨糖是生物萃取得來，比較安全，沒有副作用及藥物依賴性，但成年人每日食用量最好控制在2000mg以下。所以任何氨糖補充劑中的氨糖含量還是需要控制測定。目前國內(nèi)外都有氨糖含量測定的方法，也包括一些法定方法，主要是HPLC法，它們普遍存在一些缺陷：比如方法對實驗室檢測環(huán)境要求太高（溫度控制很嚴格），檢測結果重現(xiàn)性不好等。而很多實驗室的環(huán)境控制達不到方法的要求，就會出現(xiàn)檢測結果偏差大，不穩(wěn)定等現(xiàn)象，為了解決這一難題，本發(fā)明通過對樣品處理和色譜條件的改善，運用高效液相色譜儀高效準確的分析氨糖的含量。本方法降低了對實驗室的環(huán)境控制的要求，提高了樣品檢測的準確性，也減少了檢測成本。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種運用高效液相色譜法測定氨糖含量的方法，其準確測定氨糖含量，減少實驗室環(huán)境對方法的影響，降低實驗室檢測成本，提高檢測準確度、重現(xiàn)性，本發(fā)明對環(huán)境要求不高，樣品溶液也比較穩(wěn)定，存在檢測精度高，重復性好的優(yōu)點；同時，該發(fā)明減少了溶劑使用量，分析成本大大降低，提供了一種簡便、快捷、準確且低成本測定氨糖含量的高效液相色譜分析方法，檢測產(chǎn)品可以是原料、純氨糖片、氨糖MSM片、氨糖軟骨素片等產(chǎn)品，適用范圍廣，實用性強。本發(fā)明是通過下述技術方案來解決上述技術問題的：一種運用高效液相色譜法測定氨糖含量的方法，其包括以下步驟：步驟一，對照品溶液的配制；步驟二，樣品處理；步驟三，確定液相色譜條件；所述，步驟一包括以下步驟：步驟十一，采用USP標準品作為氨糖對照品，精密稱定適量的D-氨基葡萄糖鹽酸鹽對照品置一容量瓶中，加入醋酸鈉溶液，超聲溶解；步驟十二，用醋酸鈉溶液稀釋至刻度，混勻作為標準儲備液；吸取適量標準儲備液至另一容量瓶中，加異硫氰酸苯酯，再加甲醇，超聲溶解，加甲醇/水至刻度，混勻，水浴中加熱，冷卻至室溫；步驟十三，轉移上述溶液約適量至離心管中，加入庚烷，振搖，將甲醇層轉移至HPLC瓶中，進樣；所述，步驟二包括以下步驟：步驟二十一，精密稱取一定量的供試品置一容量瓶中，加入適量醋酸鈉溶液，超聲溶解；步驟二十二，用醋酸鈉溶液稀釋至刻度，混勻；步驟二十三，吸取適量上述溶液至另一容量瓶中，加異硫氰酸苯酯，再加甲醇，超聲溶解，加甲醇/水至刻度，混勻，水浴中加熱，冷卻至室溫；步驟二十四，轉移上述溶液適量至離心管中，加入庚烷，振搖，將甲醇層轉移至HPLC瓶中，進樣；所述，步驟三包括以下步驟：步驟三十一，選擇高效液相色譜儀和帶紫外檢測器；步驟三十二，選擇產(chǎn)品參數(shù)為C18，50mm×4.6mm，2.7μm的色譜柱；步驟三十三，設定流速為1.0mL/min；步驟三十四，設定第一流動相為磷酸溶液；第二流動相為乙腈；梯度如下表所示：時間（min）第一流動相第二流動相085%15%1.585%15%2.00%100%3.50%100%5.085%15%7.085%15%步驟三十五，設定檢測波長為UV240nm；步驟三十六，設定柱溫為25℃；步驟三十七，設定進樣量為2μL。優(yōu)選地，所述步驟十一中氨糖的含量的計算公式如下式所示：其中：A對、A樣分別為對照品、樣品的峰面積；W對為對照品的重量，mg；W樣為樣品的重量，g；C對為對照品的含量。優(yōu)選地，所述步驟十二中的標準儲備液的配制為：精密稱定適量的D-氨基葡萄糖鹽酸鹽對照品置一容量瓶中，加入0.1mol/L醋酸鈉溶液，超聲溶解，用0.1mol/L醋酸鈉溶液稀釋至刻度，混勻作為標準儲備液，其濃度約為1.0mg/ml。優(yōu)選地，所述步驟一中的溶液的配制為：吸取標準儲備液適量至另一容量瓶中，加350μl異硫氰酸苯酯（PITC），再加10ml甲醇，超聲溶解，加甲醇/水（65/35）至刻度，混勻，80℃水浴中加熱10min，冷卻至室溫；轉移上述溶液5ml溶液至離心管中，加入5ml庚烷，振搖2min，將甲醇層轉移至HPLC瓶中，進樣。優(yōu)選地，所述步驟二中的樣品處理為：稱取一定量的供試品置一容量瓶中，加入0.1mol/L醋酸鈉溶液，超聲溶解；用0.1mol/L醋酸鈉溶液稀釋至刻度，混勻；吸取上述溶液至另一容量瓶中，加350μl異硫氰酸苯酯，再加10ml甲醇，超聲溶解，加甲醇/水至刻度，混勻，80℃水浴中加熱10min，冷卻至室溫；轉移上述溶液5ml溶液至離心管中，加入5ml庚烷，振搖2min，將甲醇層轉移至HPLC瓶中，進樣。本發(fā)明的積極進步效果在于：本發(fā)明準確測定氨糖含量，減少實驗室環(huán)境對方法的影響，降低實驗室檢測成本，提高檢測準確度、重現(xiàn)性，用醋酸鈉、異硫氰酸苯酯對樣品進行衍生化處理，再用甲醇水提取，最后用庚烷振搖萃取出未反應的PITC，得到甲醇層溶液分析；對環(huán)境要求不高，樣品溶液也比較穩(wěn)定，存在檢測精度高，重復性好的優(yōu)點；采用5cmC18柱代替?zhèn)鹘y(tǒng)的25cmC18柱，檢測速度提高了5倍，同時也減少了溶劑使用量，分析成本大大降低，提供了一種簡便、快捷、準確且低成本測定氨糖含量的液相方法，檢測產(chǎn)品可以是原料、純氨糖片、氨糖MSM片、氨糖軟骨素片等產(chǎn)品，適用范圍廣，實用性強。附圖說明圖1A為本發(fā)明中實施例1的標準品測定的結果圖。圖1B為本發(fā)明中實施例1的樣品測定的結果圖。圖2A為本發(fā)明中實施例2的標準品測定的結果圖。圖2B為本發(fā)明中實施例2的樣品測定的結果圖。圖3A為本發(fā)明中實施例3的標準品測定的結果圖。圖3B為本發(fā)明中實施例3的樣品測定的結果圖。圖4為本發(fā)明運用高效液相色譜法測定氨糖含量的方法的流程圖。具體實施方式下面結合附圖給出本發(fā)明較佳實施例，以詳細說明本發(fā)明的技術方案。如附圖4所示，本發(fā)明運用高效液相色譜法測定氨糖含量的方法包括以下步驟：步驟一，對照品溶液的配制；步驟二，樣品處理；步驟三，確定液相色譜條件；所述，步驟一包括以下步驟：步驟十一，采用USP標準品作為氨糖對照品，精密稱定適量的D-氨基葡萄糖鹽酸鹽對照品置一容量瓶中，加入醋酸鈉溶液，超聲溶解；步驟十二，用醋酸鈉溶液稀釋至刻度，混勻作為標準儲備液；吸取適量標準儲備液至另一容量瓶中，加異硫氰酸苯酯（PITC），再加甲醇，超聲溶解，加甲醇/水至刻度，混勻，水浴中加熱，冷卻至室溫；步驟十三，轉移上述溶液約適量至離心管中，加入庚烷，振搖，將甲醇層轉移至HPLC瓶中，進樣；所述，步驟二包括以下步驟：步驟二十一，精密稱取一定量的供試品置一容量瓶中，加入適量醋酸鈉溶液，超聲溶解；步驟二十二，用醋酸鈉溶液稀釋至刻度，混勻；步驟二十三，吸取適量上述溶液至另一容量瓶中，加異硫氰酸苯酯（PITC），再加甲醇，超聲溶解，加甲醇/水至刻度，混勻，水浴中加熱，冷卻至室溫；步驟二十四，轉移上述溶液適量至離心管中，加入庚烷，振搖，將甲醇層轉移至HPLC瓶中，進樣；所述，步驟三包括以下步驟：步驟三十一，選擇高效液相色譜儀和帶紫外檢測器；步驟三十二，選擇產(chǎn)品參數(shù)為C18，50mm×4.6mm，2.7μm的色譜柱；步驟三十三，設定流速為1.0mL/min；步驟三十四，設定第一流動相為磷酸溶液；第二流動相為乙腈；梯度如下表所示時間（min）第一流動相第二流動相085%15%1.585%15%2.00%100%3.50%100%5.085%15%7.085%15%步驟三十五，設定檢測波長為UV240nm；步驟三十六，設定柱溫為25℃；步驟三十七，設定進樣量為2μL。所述步驟十一中氨糖的含量的計算公式如下式所示：其中：A對、A樣分別為對照品、樣品的峰面積；W對為對照品的重量，mg；W樣為樣品的重量，g；C對為對照品的含量。所述步驟十二中的標準儲備液的配制為：精密稱定適量的D-氨基葡萄糖鹽酸鹽對照品置一容量瓶中，加入0.1mol/L醋酸鈉溶液，超聲溶解，用0.1mol/L醋酸鈉溶液稀釋至刻度，混勻作為標準儲備液，其濃度約為1.0mg/ml。所述步驟一中的溶液的配制為：吸取標準儲備液適量至另一容量瓶中，加350μl異硫氰酸苯酯（PITC），再加10ml甲醇，超聲溶解，加甲醇/水（65/35）至刻度，混勻，80℃水浴中加熱10min，冷卻至室溫；轉移上述溶液5ml溶液至離心管中，加入5ml庚烷，振搖2min，將甲醇層轉移至HPLC瓶中，進樣。所述步驟二中的樣品處理為：稱取一定量的供試品置一容量瓶中，加入0.1mol/L醋酸鈉溶液，超聲溶解；用0.1mol/L醋酸鈉溶液稀釋至刻度，混勻；吸取上述溶液至另一容量瓶中，加350μl異硫氰酸苯酯（PITC），再加10ml甲醇，超聲溶解，加甲醇/水（65/35）至刻度，混勻，80℃水浴中加熱10min，冷卻至室溫；轉移上述溶液5ml溶液至離心管中，加入5ml庚烷，振搖2min，將甲醇層轉移至HPLC瓶中，進樣。本發(fā)明適用于氨糖原料、純氨糖片、含MSM的氨糖片、含硫酸軟骨素的氨糖片。實施例1氨基葡萄糖鹽酸鹽顆粒（21-727）中氨糖含量的測定：本發(fā)明所用試劑及配制：醋酸鈉（分析純）、異硫氰酸苯酯（分析純）、甲醇（色譜純）、庚烷（色譜純）、乙腈（色譜純）、磷酸（分析純）；標準儲備液的配制：精密稱定適量的D-氨基葡萄糖鹽酸鹽對照品置一容量瓶中，加入0.1mol/L醋酸鈉溶液，超聲溶解。用0.1mol/L醋酸鈉溶液稀釋至刻度，混勻作為標準儲備液，其濃度約為1.0mg/ml。標準工作溶液的配制：吸取標準儲備液適量至另一容量瓶中，加350μl異硫氰酸苯酯（PITC）,再加10ml甲醇，超聲溶解，加甲醇/水（65/35）至刻度，混勻，80℃水浴中加熱10min，冷卻至室溫；轉移上述溶液約5ml溶液至離心管中，加入約5ml庚烷，振搖2min，將甲醇層轉移至HPLC瓶中，進樣。樣品處理：稱取一定量的供試品置一容量瓶中，加入約0.1mol/L醋酸鈉溶液，超聲溶解。用0.1mol/L醋酸鈉溶液稀釋至刻度，混勻；吸取上述溶液至另一容量瓶中，加350μl異硫氰酸苯酯（PITC），再加10ml甲醇，超聲溶解，加甲醇/水（65/35）至刻度，混勻，80℃水浴中加熱10min，冷卻至室溫；轉移上述溶液5ml溶液至離心管中，加入5ml庚烷，振搖2min，將甲醇層轉移至HPLC瓶中，進樣。液相色譜條件：儀器：高效液相色譜儀,帶紫外檢測器；色譜柱：C18柱，50mm×4.6mm，2.7μm流速：1.0mL/min檢測波長：UV240nm柱溫：30℃進樣量：2μL第一流動相：磷酸溶液；第二流動相：乙腈；梯度如下表所示：時間（min）第一流動相第二流動相085%15%1.585%15%2.00%100%3.50%100%5.085%15%7.085%15%計算公式如下式所示：樣品檢測結果如附圖1A、附圖1B所示。實施例2GlucosamineSulfate2KCL1000mgTablet（GT2L）（江蘇艾蘭得營養(yǎng)品有限公司生產(chǎn)）樣品中氨糖含量的測定：具體步驟同第一實施例1，樣品檢測結果如附圖2A、附圖2B所示。實施例3氨糖軟骨素維生素D鈣片（GT0Q）（江蘇艾蘭得營養(yǎng)品有限公司生產(chǎn)）樣品中氨糖含量的測定：具體步驟同第一實施例1，樣品檢測結果如附圖3A、附圖3B所示。以上所述的具體實施例，對本發(fā)明的解決的技術問題、技術方案和有益效果進行了進一步詳細說明，所應理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁1 2 3